Biotechnologické využití rostlinných virů

Abstract

The latest model of tertiary structure of capsid protein of potato virus X (PVX CP) was used as a template to design new insertion sites suitable for the preparation of PVX-based antigen presentation system. Based on this model, seven insertion sites (A-G) located in putative surface loops were tested. As an antigen inserted into these sites was used 17 amino acids long epitope derived from human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein (E7 epitope) fused with either 6xHis tag or StrepII tag in both possible orientations (6xHis-E7 and E7-6xHis, StrepII-E7 and E7-StrepII). Prior to plant expression, modified PVX CPs were expressed in Escherichia coli MC1061. The results showed that only PVX CP carrying StrepII-E7 or E7-StrepII in the insertion site A formed virus particles. The results from transient expression experiments with modified PVX CPs in Nicotiana benthamiana showed that only the insertion site A (located between 24th and 25th amino acid in the PVX CP) could tolerate all tested inserts. Importantly, viral particles were detected only in the presence of StrepII tag and their stability was affected by the insert orientation (StrepII-E7 vs. E7-StrepII) as only the viral particles presenting E7-StrepII could be purified. Besides the preparation of PVX-based antigen presentation system, an...

Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na...