"Studium lipoproteinů metodou SEC-LLSD"

Abstract

Pro diagnostiku poruch lipidového metabolismu, které je třeba podrobně sledovat u řady společensky závažných onemocnění, se v posledních 10 letech ukazuje jako velmi přínosné stanovení velikosti částic jednotlivých lipoproteinových tříd, především lipoproteinu o nízké hustotě. Z několika známých metod jsme zvolili gelovou filtraci s detektorem rozptylu světla. Lipoproteinové frakce byly separovány ultracentrifugací z plazmy čtyř dárců. Rutinně byly stanoveny biochemické parametry - celkový cholesterol, triacylglycerol a celková bílkovina - pro plazmu i pro jednotlivé frakce. Kolona plněná silikagelem BioBasic SEC 300x7,8 mm byla kalibrována proteiny thyroglobulinem, ovalbuminem a angiotenzinem II s UV detekcí (280 nm). Tyto proteiny nejsou vhodné (velikostí) pro kalibraci metody SEC- LLSD. Proto byly vyzkoušeny latexové kuličky různých modifikací a velikostí. Jediný záznam se podařilo získat od latexových kuliček barvených tmavě modře o velikosti 55 nm, ostatní zůstaly zadržené v koloně. Lipoproteinové frakce VLDL a LDL byly zkoumány metodou SEC-LLSD při různém pH (7,3; 7,5; 7,7; 8,0) a iontové síle (0,1M fosfátový pufr, 0,1M fosfátový pufr a 0,9% NaCl, 0,05M fosfátový pufr a 0,9% NaCl). Optimální mobilní fáze je 0,1M fosfátový pufr a 0,9% NaCl. Dále byla provedena analýza spojených frakcí VLDL a...

The disorders of the lipid metabolism have to be monitored for a number of socially significant diseases. For the diagnosis of these disorders, it turned out in the last 10 years as very beneficial to determine the particle size of the individual lipoprotein classes, in particular the low-density lipoprotein. Among several known methods, we have chosen gel filtration with the light scattering detector. Lipoprotein fractions were separated by ultracentrifugation from the plasma of four donors. Three biochemical parameters - total cholesterol, triacylglycerol, and total protein - were routinely determined for plasma and for each fraction. The silica column BioBasic SEC 300x7,8 mm was calibrated by the proteins thyroglobulin, ovalbumin and angiotensin II with UV detection (280 nm). These proteins are not suitable (due to the size) for the calibration method SEC-LLSD. Therefore, latex beads of various modifications and sizes were tested. The only usable measurement was obtained for the deep-blue latex beads of the size 55 nm, the others remained retained in the column. The lipoprotein fractions of VLDL and LDL were examined by the SEC-LLSD method at different pH (7.3, 7.5, 7.7, 8.0) and ionic strength (0.1M phosphate buffer, 0.1M phosphate buffer and 0.9% NaCl, 0.05M phosphate buffer and 0.9% NaCl)....