New functionalized nucleic acids for application in chemical biology

Abstract

4 Abstract This work is focused on the synthesis of the modified 2'-deoxyribonucleoside triphosphates, their incorporation into DNA and use in chemical biology applications. The synthetic routes to the double-headed nucleosides and nucleotide triphosphates in which the two nucleobases were connected via ethynyl or propargyl linker has been developed. (Cytosin-5-yl)ethynyl, 3-(cytosin-1-yl)prop-1-yn-1-yl and 3-(5-fluorocytosin-1-yl)prop-1-yn- 1-yl derivatives of pyrimidine and 7-deazaadenine 2'-deoxyribonucleosides and nucleoside triphosphates were prepared by aqueous palladium-catalyzed cross-coupling reactions. The double-headed modified nucleoside triphosphates were good substrates for DNA polymerases suitable for primer extension and PCR construction of DNA bearing linked cytosine or 5- fluorocytosine in the major groove mimicking the flliped-out nucleotide. The assay for the testing of the inhibition of DNA methyltransferases was developed. Next, the transient protection of DNA against cleavage by restriction endonucleases (REs) using (trialkylsilyl)ethynyl modified DNA was developed. A series of 7-(trialkylsilyl)ethynyl-7- deaza-2'-deoxyadenosine triphosphates was prepared and they were shown to be incorporated into DNA by primer extension and/or PCR using KOD XL polymerase. The deprotection conditions...

5 Abstrakt Tato práce je zaměřena na syntézu modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid trifosfátů, jejich inkorporaci do DNA a aplikaci v chemické biologii. Byla vyvinuta syntéza "douhlavých" nukleosidů a nukleosid trifosfátů, které obsahují ethynylový nebo propargylový můstkem mezi dvěmi bázemi. (Cytosin-5-yl)ethynyl, 3-(cytosin-1-yl)prop-1-yn-1-yl a 3-(5- fluorcytosin-1-yl)prop-1-yn-yl substituované pyrimidiny a 7-deazaadeniny 2'- deoxyribonukleosidů a nukleosid trifosfátů byly připraveny palladiem katalyzovanou cross- coupling reakcí ve vodném prostředí. Tyto 2'-deoxyribonukleosid trifosfáty obsahující dvě nukleobáze jsou dobrými substráty pro DNA polymerasy v primer extension reakci a PCR a tudíž vhodné pro přípravu DNA s cytosinem nebo 5-fluorcytosinem ve velkém žlábku, která tak napodobuje nukleobázi vyjmutou ven z DNA dvoušroubovice. Byla také vyzkušena metoda pro testování inhibice DNA methyltransferáz. Dále, bylo vyvinuto přechodné chránění DNA proti štěpení restrikčními endonukleázami (RE) za pomocí (trialkylsilyl)ethynyl modifikované DNA. Bylo dokázáno, že všechny připravené (trialkylsilyl)ethnyl-modifikované 7-deaza-2'-deoxyadenosin trifosfáty se inkorporují do DNA KOD XL polymerásou v primer extension reakci a nebo pomocí PCR. Podmínky potřebné pro odchránění trialkylsilylové chránicí skupiny byly...