Struktura a interakce lidského regulačního proteinu 14-3-3 pomocí in vitro fotoafinitního značení s využitím proteinových nano-sond a hmotnostní spektrometrie

Abstract

Tato bakalářská práce je zaměřená na studium struktury a mechanismu lidského proteinu 14-3-3, který patří mezi významné regulační proteiny vyskytující se ve všech eukaryotických buňkách. V dnešní době je u savců známo 7 isoforem tohoto proteinu a přestože jejich krystalová struktura vykazuje vysokou podobnost, můžeme pozorovat několik změn. Cílem této práce je příprava experimentálního nástroje, který umožní ověřit, zda jsou tyto rozdíly v krystalové struktuře isoformy ζ přítomné i v roztocích proteinů a současně zda ovlivňují strukturně funkční mechanismus této isoformy. Optimalizace exprese rekombinantního proteinu 14-3-3zeta s inkorporovaným fotoaktivovatelným analogem leucinu v sekvenci proteinu byla provedena v limitním médiu s prokaryotním expresním systémem E. coli BL-21 DE3 Gold, nebo auxotrofním systémem E. coli K-12 bez funkční biosynthesy leucinu.

This thesis is focused on the study of the structure and mechanism of human 14- 3-3 protein, which is one of the important regulatory proteins present in all eukaryotic cells. Nowadays it is known seven isoforms of this protein in mammals. Although their crystal structure shows a high similarity, their mutual comparison reveals some changes. The aim of this work is to prepare experimental tools for verification whether the differences in the crystal structure of the ζ isoform are present in solution and how the structure-functional mechanism of this isoform is affected. The otimization of 14-3- 3zeta recombinant protein expression with incorporated a photo-labile analog of leucine in the protein sequence was performed using limiting medium with prokaryotic expression system of E. coli BL-21 DE3 Gold or system of auxotrophic E. coli K-12 with non-functional leucine biosynthesis.