Development of ultrastructural methods and their application in studies on the cell nucleus

Abstract

Despite the capabilities of molecular-biological methods in deciphering the interplay of different biological molecules and molecular complexes, the understanding of respective functions in living cells requires application of in situ methods. Obviously, these methods should provide maximal resolution and the best possible preservation of the biological object in a native state, as well as correct statistical evaluation of the spatial characteristics of detected molecular players. Transmission electron microscopy provides the highest possible resolution for analysis of biological samples. The simultaneous detection of biological molecules by means of indirect immunolabeling provides valuable information about their localization in cellular compartments and their possible interactions in macromolecular complexes. To analyze this, we have developed a complex stereological method for statistical evaluation of immunogold clustering and colocalization patterns of antigens on ultrathin sections, including a user-friendly interface. Functional microarchitecture of DNA replication and transcription sites has been successfully characterized using the developed stereological tools. Our data demonstrate that DNA replication is compartmentalized within cell nuclei at the level of DNA foci and support the view...

SOUHRN Navzdory možnostem, které přinášejí molekulárně-biologické metody při odhalování souhry různých biologických molekul a molekulárních komplexů, pochopení jednotlivých funkcí v živých buňkách vyžaduje použití in situ metod. Je zřejmé, že tyto metody by měly zajistit maximální rozlišení a nejlepší možné zachování biologického objektu v přirozeném stavu, stejně jako správné statistické vyhodnocení prostorových charakteristik lokalizace detekovaných molekulárních komplexů. Transmisní elektronová mikroskopie poskytuje nejlepší možné rozlišení pro analýzu biologických vzorků. Současná detekce více biologických molekul metodou nepřímého imunoznačení je zdrojem cenných informací o jejich lokalizaci v buněčných kompartmentech a jejich potenciálních interakcí v makromolekulárních komplexech. Vyvinuli jsme komplexní stereologickou metodu pro statistické hodnocení klastrování a kolokalizace značených antigenů na ultratenkých řezech, včetně uživatelsky přívětivého softwarového rozhraní. Dále jsme charakterizovali funkční mikroarchitekturu replikačních a transkripčních domén pomocí vyvinutých algoritmů. Výsledky ukazují, že DNA replikace je v buněčném jádře kompartmentalizována na úrovni DNA ohnisek a nasvědčují modelu, ve kterém centra syntézy DNA jsou zakotvena a chromatinové smyčky se pohybují. V HeLa buňkách...