Rozvoj postkolonového generování hydridů pro analýzu glutathionových komplexů arsenu pomocí HPLC-(HG)-ICP-MS

Abstract

Diplomová práce se zabývá metodou kapalinové chromatografie s postkolonovým generováním hydridů ve spojení s hmotnostní detekcí s indukčně vázaným plazmatem (HPLC-HG-ICP-MS) pro analýzu glutathionových komplexů arsenu v biologických vzorcích. Cílem bylo ověřit vhodnost metody a provést pilotní studie na enzymatické methylační směsi arsenu s glutathionem a v moči. Zařazení kroku postkolonového generování hydridů řeší problém změny citlivosti ICP-MS při použití gradientové eluce. Pomocí standardů glutathionových komplexů bylo ověřeno, že metoda HPLC-HG-ICP-MS umožňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu těchto komplexů. Mez detekce byla stanovena na 5 pg/ml. Analýzou methylační směsi arsenu s glutathionem bylo zjištěno, že ve směsi se v průběhu methylace vyskytuje pouze komplex dimethylarsen glutathion (DMAs(GS)) a bylo ověřeno, že přítomnost enzymu je pro vznik komplexu nezbytná. Ve vzorcích moči neexponovaných lidí analyzovaných metodami HPLC-HG-ICP- MS a generováním hydridů s vymrazováním ve spojení s hmotnostní detekcí s indukčně vázaným plazmatem (HG-CT-ICP-MS) byla zjištěna pouze přítomnost volných pětimocných arsenových specií, glutathionové komplexy ani trojmocné specie pozorovány nebyly.

This thesis develops high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-HG-ICP-MS) method used for the analysis of glutathione arsenic complexes in biological samples. The aim of the thesis was to verify the suitability of this methods and to perform pilot studies on analysis of the enzymatic methylation assay containing glutathione and urine. Inclusion of post-column hydride generation step resolves the problem of changing sensitivity of ICP-MS with gradient elution. Using the standards of glutathione complexes, it was verified that the HPLC-HG-ICP-MS method can provide both qualitative and quantitative analysis of these complexes. The limit of detection was found at 5 pg/ml. Analysis of the methylation assay of arsenic with glutathione showed that only DMAsGS complex occurs in the assay during methylation. It was verified that the presence of the enzyme is required for the complex formation. In the samples of urine from unexposed people analyzed by HPLC- HG-ICP-MS and hydride generation-cryotrapping-inductively coupled plasma mass spectrometry (HG-CT-ICP-MS), only the presence of free pentavalent arsenic species was found, whereas neither glutathione complexes nor trivalent species could be observed.