The study of model membrane systems, proteins and protein-membrane interactions using various fluorescence techniques

Abstract

Membránové rafty (také často uváděny jako nanodomény) jsou membránové struktury, které jsou zodpovědné za spoustu buněčných procesů. Jejich charakterizace je velice složitá, protože nanodomény jsou opticky průhledné, jejich velikost je pod rozlišením optických mikroskopů a dynamika je veliká. Navíc vysoká různorodost buněk ještě více komplikuje jejich studium. Pro zjednodušení buněk jsou velice často používány membránové modelové systémy jako obrovské unilamelární vezikuly (GUVs) nebo podporované fosfolipidové dvojvrstvy (SPBs). V mé disertační práci byly vyvinuty, testovány a vylepšovány různé fluorescenční techniky ke studiu těchto membránových domén v modelových systémech. Fázorová analýza, metoda pro analýzu dat dob dohasínání fluorescence, byla teoreticky a experimentálně testována a následně použita k charakterizaci membránových nanodomén v GUVs. Nejdříve jsme využili fázorovou analýzu v lipidových vezikulech ke studiu procesů excitovaných stavů, jako je jev relaxace rozpouštědla a Försterův rezonanční přenos energie (FRET). Dále jsme aplikovali fázorovou analýzu k charakterizaci interakcí mezi proteiny a ligandy, ke studiu sbalování a denaturace proteinů. Nakonec jsme použili fázorovou analýzu dat z FRET v kombinaci s fluorescenční korelační spektroskopií (FCS) k charakterizaci membránových...

Membrane rafts (also referred as nanodomains) are membrane structures responsible for many cell processes. Their characterization is challenging because of the transparency, dynamics and small size of those structures. Moreover, high variability of cells makes their study even more complicated. In order to simplify the studies of membrane processes including the formation of those rafts often model membranes like Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) and Supported Phospholipid Bilayers (SPBs) are used. In this Thesis new fluorescent tools for studying such membrane processed were developed, tested, or improved. Specifically, the phasor plot an approach applicable to the analysis of the fluorescence lifetime data, was theoretically and experimentally tested and afterwards applied to the characterization of the membrane nanodomains in GUVs. First, we introduced the phasor plots to the excitation state processes like solvent relaxation and Förster resonance energy transfer (FRET) in lipid vesicles. We also employed the phasor plots in protein-ligand interaction, protein folding and denaturation studies. Finally, the phasor plot analysis of FRET data in combination with Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) was used in characterization of membrane nanodomains in terms of the size, mobility and...