Vliv kovalentně vázané fluorescenční značky na strukturu a funkci proteinů

Abstract

Fluorescenční značení je velmi často používanou metodou určenou k vizualizaci všech typů biomolekul včetně proteinů a proteinových komplexů. Dosud však nebylo zkoumáno, jakým způsobem a v jakém rozsahu toto značení ovlivňuje jejich strukturu a funkci. Tato diplomová práce se tedy zabývá vlivem vazby NHS-fluoresceinu na modelový protein lidské karbonát dehydratasy (hCA-I). Cílem této práce byla příprava rekombinantní 15N-hCA-I, studium její struktury pomocí NMR spektroskopie po značení fluoresceinem, studium ovlivnění relativní enzymové aktivity hCA-I v závislosti na míře fluorescenčního značení a v neposlední řadě také analýza produktů pomocí ESI FT-ICR MS vzniklých po vazbě karbonát dehydratasy NHS-fluoresceinem. Využitím těchto metod byly stanoveny obecné experimentální podmínky pro použití fluorescenčního značení s minimálním efektem na strukturu proteinu a jeho funkci. Z výsledků této práce vyplývá, že při výpočtech molárních nadbytků přidávaného NHS-fluoresceinu k proteinům nelze použít dosavadního jednoduchého postupu, ale je více než nutné zohlednit vliv relativní enzymové aktivity proteinu, která klesá se zvyšujícím se molárním nadbytkem fluorescenční značky, a že výpočet molárních nadbytků neodpovídá skutečnému stupni značení. V budoucím výzkumu bude nutné provést optimalizaci pro další...

Fluorescent labeling is a method used for visualization of various types of biomolecules including proteins and protein complexes. However, the effect of protein labeling on protein structure and functions has not been investigated so far. The goal of the diploma thesis was to examine an influence of NHS-fluorescein binding on structure and function of human carbonic anhydrase I (hCA-I). The particular aims of this work were to prepare recombinant 15N-hCA-I which was used for NMR structure analysis of carbonic anhydrase upon fluorescent labeling. Furthermore, enzyme activity was measured in order to find out a correlation between the concentration of NHS- fluorescein and protein function. In addition, the reaction mixtures were systematically analyzed by ESI FT-ICR mass spectrometry. The analysis revealed experimental conditions for fluorescent labeling of human carbonic anhydrase I with minimal effect on protein structure and function. The results of this study show that the calculation of molar excess of NHS-fluorescein cannot rely on a simple procedure provided by manufacturer. However, due to decrease of enzyme activity upon fluorescent labeling, it is better to take into count the influence of NHS-fluorescein concentration on the relative enzymatic activity. Moreover, the calculation of molar...