Studium variability IRES elementů viru hepatitidy typu C

Abstract

Virus hepatitidy typu C (HCV) obsahuje na 5ʹ konci svého RNA genomu vnitřní vazebné místo pro ribosom (IRES). IRES HCV je schopno přímo na sebe vázat 40S malou ribosomální podjednotku a eukaryotický iniciační faktor eIF3 a po sestavení kompletního 80S ribosomu zahájit translaci. Jako inhibitory funkce IRES HCV se uplatňují molekuly různé povahy. Z klinického hlediska jsou slibnou skupinou nízkomolekulární sloučeniny. V první řadě se proto tato diplomová práce zabývá přípravou systému pro hledání nízkomolekulárních inhibitorů IRES HCV v knihovně chemických sloučenin. Byly připraveny různé varianty vektorů nesoucí bicistronické kazety. Po ověření jejich funkčnosti pomocí transientní transfekce savčích buněčných linií byly ustaveny stabilní savčí buněčné linie. Díky těmto stabilním buněčným liniím bude možno proces hledání nízkomolekulárních inhibitorů IRES HCV zautomatizovat. Druhým tématem je studium variability sekvencí IRES HCV izolovaných ze vzorků od pacientů. Vzorky IRES HCV byly analyzovány pomocí gelové elektroforesy v teplotním gradientu (TGGE). Vybrané vzorky byly osekvenovány, vloženy do vektoru s bicistronickou kazetou a analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Byla tak určeno, jak ovlivňují konkrétní mutace v sekvenci IRES HCV míru translace závislé na daném IRES. Porovnáním dvou skupin...

Hepatitis C virus (HCV) has an internal ribosomal binding site (IRES) located near the 5ʹ end of its genome. The HCV IRES is capable of direct binding to the 40S small ribosomal unit and eukaryotic initiation factor eIF3, and can initiate translation after the assembly of the whole 80S ribosome. Various molecular types can act as IRES inhibitors. Small molecule compounds seem to be the most promising agent for use in the clinic. The main objective of the thesis was to develop a system for searching for small molecule compound inhibitors of HCV IRES in a library of chemical compounds. Several variants of vector carrying bicistronic cassettes were prepared. After validating their functionality by transient transfection of mammalian cell cultures, mammalian stable cell lines were established. These stable cell lines will allow for automatization of the search for small molecule compound inhibitors of HCV IRES. Our second objective was to study the variability of HCV IRES sequences in patient samples. The samples were analysed by temperature gradient gel electrophoresis (TGGE). Select specimen were sequenced, cloned into a vector with bicistronic cassette and analysed by flow cytometry. In this was we evaluated the effect of specific mutations in the HCV IRES sequence on the level of IRES dependent...