Oxidace benzo(a)pyrenu cytochromem P450 1A1 exprimovaným v prokaryotickém a eukaryotickém systému

Abstract

Benzo[a]pyren (BaP) je významným lidským kancerogenem. Je metabolizován řadou enzymových systémů jako jsou cytochromy P450 (CYP) a epoxidhydrolasa. Cílem předkládané diplomové práce bylo studium metabolismu BaP in vitro jaterním mikrosomálním systémem potkanů premedikovaných induktory cytochromů P450 a dále lidským cytochromem P450 1A1 (CYP1A1) exprimovaným v eukaryotickém a prokaryotickém systému. Eukaryotický expresní systém byl tvořen mikrosomy izolovanými z hmyzích buněk, zatímco prokaryotický expresní systém tvořily "zlomky" membrán E. coli. V rámci rekombinantního lidského CYP1A1 byl zkoumán vliv cytochromu b5, NADPH:cytochrom P450 reduktasy (CPR) a epoxidhydrolasy na oxidaci BaP. Izolace a purifikace králičí jaterní CPR byla dalším cílem této práce. Metabolity vzniklé oxidací BaP byly separovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že jaterní mikrosomální systémy potkanů premedikovaných induktory CYP podrodiny 1A (Sudanem I), podrodiny 2B (fenobarbitalem) a podrodiny 3A (PCN) vykazují vyšší efektivitu oxidovat BaP než mikrosomy kontrolních potkanů. BaP je oxidován lidským CYP1A1 exprimovaným v eukaryotickém systému na šest metabolitů (BaP-9,10-dihydrodiol, metabolit BaP s dosud neurčenou strukturou, BaP-7,8-dihydrodiol, BaP-1,6-dion, BaP-3,6-dion a BaP-3-ol), zatímco...

Benzo[a]pyrene (BaP) is a human carcinogen, which is metabolized by a variety of enzyms such as cytochrome P450 (CYP) and epoxide hydrolase. The aim of this work was to study BaP metabolism in vitro by the hepatic microsomal system of rats treated with CYP inducers and by human cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) expressed in eukaryotic and prokaryotic systems. An eukaryotic expression system consisted of microsomes isolated from insect cells, whereas a prokaryotic expression system was formed by the membrane fragments of E. coli. In the case of recombinant human CYP1A1, we investigated the influence of cytochrome b5, NADPH:cytochrome P450 reductase (CPR) and epoxide hydrolase in BaP oxidation. Isolation and purification of rabbit hepatic CPR was another aim of this work. BaP metabolites were separated by HPLC. The results found in this work demostrate the fact that hepatic microsomal systems of rats treated with an inducer of CYP1A (Sudan I), an inducer of CYP2B (phenobarbital) and an inducer of CYP3A (PCN) exhibit higher efficiency of BaP oxidation than microsomes of control rats. BaP is oxidized by human CYP1A1 expressed in the eukaryotic system to six metabolites (BaP-9,10-dihydrodiol, BaP metabolite with unknown structure, BaP-7,8-dihydrodiol, BaP-1,6-dion, BaP-3,6-dion, BaP-3-ol), whereas by human...