Příprava kvasinkového systému pro studium lidské iniciace translace

Abstract

Iniciace translace je vysoce regulovaný proces. Významnou roli v něm hraje komplex eIF4F, který se skládá z 3 podjednotek - eIF4A, eIF4E a eIF4G. Protein eIF4E se váže na 7-methylguanozinovou čepičku na 5' konci mRNA, helikáza eIF4A rozvolňuje sekundární struktury na mRNA a kostru tvoří protein eIF4G. Spolupráce s dalšími iniciačními faktory je důležitá pro zahájení tvorby proteinů. Cílem mé práce bylo přispět k vytvoření kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae s humanizovaným eIF4F faktorem. Nejprve jsem nahradila protein eIF4E kvasinky Saccharomyces cerevisiae za lidský protein eIF4E. S využitím delečních kazet a cre/loxP rekombinace jsem připravila kmeny s delecemi v genech eIF4GI (huΔ4G1) a eIF4GII (huΔ4G2). Charakterizace nově získaných kmenů překvapivě ukázala, že lidský eIF4E protein nahrazuje odpovídající kvasinkový orthologní faktor lépe než eIF4E z evolučně výrazně bližší Candida albicans. Pilotní pokusy s nově získanými kmeny a s kmeny závislými na eIF4E z Candida albicans též ukázaly na možný význam kvasinkového eIF4GII pro růst buněk během teplotního a osmotického stresu. Klíčová slova: iniciace translace, eIF4E, eIF4G, Saccharomyces cerevisiae

Protein synthesis is principally regulated at the initiation stage in which eIF4F complex plays an important role. The eIF4F complex contains three subunits - eIF4A, eIF4E and eIF4G. The eIF4E is cap binding protein, the eIF4A is RNA dependent helicase which unwinds secondary structures at mRNA and scaffolding eIF4G protein. The interaction with other translation initiation factors is important for protein synthesis. The goal of my thesis was to create a new Saccharomyces cerevisiae yeast strain with the human eIF4F factor. Firstly I replaced yeast eIF4E protein with human eIF4E protein. I used a cre/loxP recombination to prepare yeast strains with deleted genes eIF4GI (huΔ4G1) and eIF4GII (huΔ4G2). Characterization of the new yeast strains showed that the human eIF4E protein replaced yeast ortholog factor better than the eIF4E protein from yeast Candida albicans. First experiments showed putative role of the eIF4GII protein during the cell growth under the temperature and osmotic stress. Key words: translation initiation, eIF4E, eIF4G, Saccharomyces cerevisiae