Analýza regulace komplexů cytoplazmatických poly(A) polymeráz

Abstract

Regulace genové exprese je dosahováno mnoha způsoby. Výzkum se dlouhá léta zaměřoval především na regulaci genové exprese na úrovni chromatinu, nicméně posttranskripční regulace se na cestě k syntéze proteinů ukazuje být jejím nezbytným doplňkem. Tato práce se zaměřuje na studium jednoho specifického mechanismu posttranskripční kontroly - regulace translace mRNA v buněčné cytoplazmě. Tato regulace je důsledkem rovnováhy mezi aktivací a represí translace a závisí na selektivním rozpoznání cílových mRNA RNA-vazebnými proteiny a jejich schopností navazovat proteiny modifikující RNA. V této práci byla zárodečná linie Caenorhabditis elegans využita ke studiu translační regulace mRNA genu hojně exprimovaného v zárodečné linii, gld-2. Mutanti známých RNA-vazebných proteinů z rodin proteinů PUF a CPB byli analyzováni pomocí Western blotů za použití protilátek proti GLD-2. K identifikaci cis-regulačních míst na gld-2 mRNA, zodpovídajících za regulaci translace PUF a CPB proteiny, bylo využito kvasinkového 3-hybridového systému. Také byl zkoumán potenciální autoregulační systém exprese genu gld-2. Tato práce ukazuje, že proteiny FBF pozitivně regulují expresi genu gld-2 a váží se na jednu konzervovanou sekvenci v nepřekládaném regionu na 3' konci jeho mRNA. Mutace v genu gld-2 negativně ovlivnily hladinu proteinu...

The regulation of gene expression is achieved at many levels. Chromatin-based gene regulation has been the central focus of many decades of research; however, posttranscriptional control mechanisms are emerging as a fundamental complement to direct protein synthesis. This thesis is focused on a specific mechanism of posttranscriptional control - the translational regulation of mRNAs in the cell cytoplasm. This control is a consequence of the balance between translational repression and activation and hinges on the selective recognition of regulated mRNAs by RNA-binding proteins and their ability to recruit RNA modifying proteins. In this thesis, Caenorhabditis elegans germline was used to study translational control of the germ cell-enriched gene, gld-2. Mutants of known RNA-binding proteins of the PUF and CPB protein families were analyzed by performing Western blots, using anti-GLD-2 antibodies. Yeast 3-Hybrid system was used to identify the cis-regulatory sites in the gld-2 mRNA conferring translational regulation by members of PUF and CPB protein families. Potential autoregulatory loop of gld-2 gene expression was also investigated. This thesis shows that FBF proteins positively regulate expression of gld-2 and bind to a conserved sequence in the 3'UTR of its mRNA. Mutations of gld-2 negatively affect...