Hmotnostní spektrometrie v proteomice: strukturní biologie a klinické aplikace

Abstract

Mass spectrometry (MS) is a rapid, specific and very sensitive analytical method with a broad spectrum of proteomic applications such as protein identification and sequencing, 3D protein structure characterization or study of protein-protein interaction. The introduction of two ionization techniques in late 1980's that are able to ionize the large biomolecules such as proteins, oligosaccharides or nucleic acids with no or low fragmentation has started the rapidly expanding field of MS-based proteomics. The presented thesis was aimed at the application of mass spectrometric approaches to answer several proteomic questions. Firstly we have employed the chemical cross-linking in combination with MS analysis to solve the 3D structure and protein-protein interactions of three model systems: (1) homodimeric human regulatory protein 14-3-3, (2) model of 14-3-3 and regulatory domain of tyrosine hydroxylase, and (3) system of two membrane proteins, cytochrome P450 2B4 and cytochrome b5, involved in xenobiotics biotransformation. This approach works in aqueous solutions under physiological conditions and thus preserves native structure of the investigated proteins. The second part of the thesis was focused on MS identification of proteins/peptides in fungal spores of Aspergillus and Pseudallescheria...

Hmotnostní spektrometrie (MS) je rychlá, specifická, citlivá a experimentálně variabilní metoda, kterou lze s úspěchem použít v celé řadě proteomických aplikací, např. při identifikaci a řešení primární struktury proteinů nebo pro studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí. Zavedení tzv. měkkých ionizačních technik na konci 80. let minulého století umožnil ionizovat bez nežádoucí fragmentace biologické makromolekuly jako jsou proteiny, oligosacharidy nebo nukleové kyseliny, a tak nejvíce ovlivnil využití hmotnostní spektrometrie na poli proteomiky. Cílem této práce bylo použití současných přístupů hmotnostní spektrometrie při řešení několika proteomických otázek. První část práce je zaměřena na studium terciární struktury a protein-proteinových interakcí pomocí kombinace techniky chemického zesítění s MS analýzou ve třech modelových systémech: (1) homodimeru lidského regulačního proteinu 14-3-3, (2) systému proteinu 14-3-3 s regulační doménou tyrosinhydroxylasy, a (3) systému dvou membránových proteinů účastnících se biotransformace xenobiotik - cytochromu P450 2B4 a cytochromu b5. Tento metodický přístup pracuje s proteiny ve vodných roztocích za fyziologických podmínek a zachovává tak jejich nativní struktury. Ve druhé části práce byly pomocí MS studovány proteinové profily...