Funkce alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při stresové odpovědi u Corynebacterium glutamicum

Abstract

Cílem práce bylo přispět k poznání funkce alternativních sigma faktorů RNA polymerasy σH a σM při stresové odpovědi u Corynebacterium glutamicum, zejména při transkripci genu sigM, který kóduje σM , a operonu dnaK-grpE-dnaJ-hspR, jehož geny kódují proteiny účastnící se odpovědi buňky C. glutamicum na tepelný stres. Promotory těchto testovaných genů byly klonovány do "promoter-probe" vektoru pET2 a jejich aktivita byla stanovována měřením specifické aktivity reportérového enzymu chloramfenikolacetyltransferasy. Byl zjištěno, že tepelný stres má slabý pozitivní efekt na aktivitu promotoru genu sigM (P-sigM), zatímco efekt oxidativního stresu působením diamidu nebyl potvrzen. Bylo prokázáno, že delece samotného genu sigH nebo sigM nevede ke snížení aktivity promotoru P-sigM za standardních podmínek ani po tepelném stresu. Naproti tomu u kmene C. glutamicum ∆sigH∆sigM došlo k úplnému potlačení aktivity tohoto promotoru. Promotor genu sigM je tedy rozeznáván za standardních podmínek i po tepelném stresu jak sigma faktorem σH , tak sigma faktorem σM , ale nikoli primárním sigma faktorem σA . Bylo zjištěno, že mutageneze v -10 oblasti promotoru genu sigM vede k jeho inaktivaci a byla prokázána nezbytnost trinukleotidu GTT 8 bp "upstream" od počátku transkripce genu sigM pro funkci promotoru P-sigM. Z...

The aim of this thesis was to contribute to understanding of the functions of the alternative sigma factors of RNA polymerase, σH a σM , during stress response of C. glutamicum. The role of σH and σM in the transcription of the gene sigM encoding σM and the genes of the operon dnaK-grpE-dnaJ-hspR which encode proteins involved in heat-shock response of C. glutamicum was studied. The promoters of the tested genes were cloned into the "promoter-probe" vector pET2 and their activity was determined by the measuring of specific activity of the reporter enzyme chloramfenicol acetyltransferase. It was found, that the heat stress has a moderate positive effect on the activity of the promoter of the gene sigM (P-sigM), whereas no effect of the oxidative stress induced by diamide was found. It was proved, that deletion of the gene sigH or sigM itself does not lead to decrease of activity of the promoter P-sigM neither in standard conditions nor after heat-shock. On the other hand, complete abolition of the activity of the promoter P-sigM was observed in the strain C. glutamicum ∆sigH∆sigM. The promoter of the gene sigM is thus recognized in standard conditions and after heat stress is recognized by both sigma factors σH and σM , but not by the sigma factor σA . It was shown, that mutation in the -10 region...