Dynamic saturation optical microscopy using photoswitchable proteins

Abstract

Fluorescenční mikroskopie je nepostradatelnou technikou pro zobrazování živých buněk. Jedním z hlavních omezení této metody je difrakcí světla limitované, relativně malé prostorové rozlišení, což je popsáno Abbeho difrakčním zákonem. V posledních letech se proto začaly rozvíjet techniky, které obchází difrakční limit za účelem zvýšení prostorového rozlišení. Jednou z těchto technik je dynamická saturační optická mikroskopie (DSOM), která je založena na prostorovém sledování kinetiky vratných přechodů mezi svítivými a nesvítivými stavy fluoroforů. Reverzibilní přechod do nesvítivého stavu může být pozorován např. u světlem přepínatelných fluorescenčních proteinů jako je Dronpa a z ní odvozené klony. Zmíněné proteiny opakovaně přecházejí mezi fluorescenčními a nefluorescenčními formami po ozáření modrým nebo ultrafialovým světlem. Tato práce se soustředí na získávání lépe rozlišených fluorescenčních obrazů na základě pozorování kinetiky přechodů v různých částech vzorku. Experimenty byly prováděny na kvasinkách exprimujících proteiny označené Dronpou. Nejdříve bylo ověřeno, zda v Dronpě dochází k přepínání mezi svítivými a nesvítivými stavy. Dále byl sledován vliv intenzity excitační světla a změna excitační vlnové délky na rychlost přepínání a fotostabilita proteinu. Měření byla prováděna na různých časových...

Fluorescence microscopy is an essential technique for live cell imaging. One of its drawbacks is a rather low diffraction limited spatial resolution, which is described by Abbe diffraction law. Therefore, in the last decade a lot of new methods improving spatial resolution were developed. One of them is dynamic saturation optical microscopy (DSOM) that is based on spatial monitoring of reversible transition kinetics between bright and dark states of fluorophores. The dark state is possible to obtain for example by using reversibly photoswitchable fluorescent proteins such as Dronpa and its variants. These proteins undergo reversible transition from fluorescent to nonfluorescent state after irradiation by blue and ultraviolet light. In my work I focus on employing the kinetics of controllable photoswitching of Dronpa in improving the overall image quality, including the spatial resolution. The experiments were performed on yeasts expressing selected proteins labelled with Dronpa. Firstly, photoswitching behaviour of Dronpa was confirmed. Secondly, experimental conditions were optimized by studying dependence of switching rate on laser intensities and on excitation wavelength and by studying protein photostability. Experiments were performed on different timescales and for various proteins. Using the optimal...