Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3

Abstract

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Dudová Radka Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3 Purifikace vektoru pOTB7 s kódovou sekvencí aldo-ketoreduktasy 1C3 ( AKR1C3 ) v buňkách Escherichia coli byla provedena metodou alkalické lýze. Kódová sekvence byla následně amplifikována polymerasovou řetězovou reakcí. Správnost výsledku provedeného kroku byla prokázána ověřením velikosti nasyntetizovaného fragmentu a restrikční analýzou s restrikční endonukleasou PvuII. V druhém kroku byla kódová sekvence ligována do vektoru Topo 2.1, který byl transformován do kompetentních buněk E. coli. Buňky byly namnoženy a vektor Topo 2.1 s vloženou kódovou sekvencí byl získán metodou alkalické lýze. Výsledek byl ověřen porovnáním velikosti vektoru Topo 2.1 bez vloženého insertu a vektoru Topo 2.1 s kódovou sekvencí na agarózovém gelu a následnou restrikční analýzou s restrikční endonukleasou HindIII. Kódová sekvence byla ověřena metodou sekvenace. Dále byla provedena subklonace kódové sekvence z vektoru Topo 2.1 do expresního vektoru pET-15b. Úspěšnost subklonace byla ověřena porovnáním velikosti prázdného pET-15b a vektoru s vloženou sekvencí. V posledním kroku byl vytvořen...

Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Dudová Radka Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D Title of diploma thesis: Cloning, expression and purification of human AKR1C3 The purification of the vector pOTB7 containing the coding sequence ( CDS ) of aldo-keto reductase 1C3 ( AKR1C3 ) in Escherichia coli ( E.coli ) cells was performed by an alkaline lysis method. The coding sequence was then amplified by polymerase chain reaction. Result accuracy of the demonstrated step was shown by verification of the size of the synthesized fragment and by a restrictive analysis with the restriction endonuclease PvuII. In the second step, the coding sequence was ligated into the Topo 2.1 vector which was transformed into competent E. coli cells. The cells were multiplied and Topo 2.1 vector with the inserted code sequence was obtained by the alkaline lysis method. The result was verified by comparing of the size of the Topo 2.1 vector without inserted CDS and the vector Topo 2.1 with the CDS on an agarose gel and the subsequent restrictive analysis with the restriction endonuclease HindIII. The coding sequence was verified by the sequenation. There was also carried out the subcloning of the CDS from the Topo 2.1 vector into the express...