Studium molekulární a biochemické podstaty primární deficience koenzymu Q10

Abstract

Tato diplomová práce se věnuje poruchám koenzymu Q10, které vedou ke snížení jeho koncentrace ve tkáních pacientů (tzv. deficience CoQ10). Zavádí dvě molekulárně-genetické metody pro analýzy deficience CoQ10 - skríningovou metodu High Resolution Melting Analysis pro usnadnění vytřídění potenciálních pacientů s mutací v genech PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ9, CABC1 a APTX, které kódují některé z enzymů účastnících se biosyntézy CoQ10, a metodu přímého sekvenování kódujících sekvencí těchto genů a jim přilehlých intronních oblastí. Dále se snaží charakterizovat model deficience CoQ10 na in vitro kultivovaných lidských fibroblastech a linii HEK293. Deficience je v tomto případě navozena působením inhibitoru biosyntézy CoQ10 - kyseliny 4-aminobenzoové o koncentraci 1 mmol.dm-3 v médiu. Bylo zjištěno, že se po 4denním působení tohoto inhibitoru koncentrace CoQ10 u kultur fibroblastů a linie HEK293 snížila na 60 - 70 % kontroly, resp. 41 % kontroly v případě linie HEK293, přitom nedošlo ke změnám viability buněk ani morfologie mitochondriálních sítí. Zjistili jsme mírné zvýšení přítomnosti reaktivních forem kyslíku po kultivaci s inhibitorem, a to zejména superoxidových radikálů, ovšem ultrastruktura mitochondrií zřejmě zůstala nezměněna. V neposlední řadě se práce věnuje změnám aktivit komplexů dýchacího řetězce a...

This diploma thesis focus on disorders of coenzyme Q10, which lead to decrease of its concentration in certain patient`s tissues (CoQ10 deficiency). This thesis introduces two molecular-genetics methods for CoQ10 deficiency analysis. The first one is a screening method - High Resolution Melting Analysis, which is a useful tool for screening of a large group of patiens with possible mutations in PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ9, CABC1 and APTX genes, which encode some enzymes of CoQ10 biosynthetic pathway. The second one is direct sequencing of coding sequences of these genes including intron sequences neighbouring exons. This work also describes a model of CoQ10 deficiency applied in vitro using cultured human skin fibroblasts and HEK293 cells. In this case CoQ10 deficiency is evoked by CoQ10 biosynthesis inhibitor - 4 aminobenzoic acid (concentration 1 mmol.dm-3) . 4 days treatment by 4 aminobenzoic acid caused decrease in CoQ10 level in fibroblasts and HEK293 cells (60 - 70 % of control, resp. 41 % of control in case of HEK293 cells), although cell viability and morfology of mitochondria remained unchanged. Our results declare that there was slightly increased reactive oxygen species concentration after treatment, especially the amount of superoxide radicals; nevertheless the ultrastructure of mitochondria stayed...