Studium receptor-ligandového páru NKR-P1F a Clrg

Abstract

Studim receptor - ligandového páru NKR-P1F a Clrg Myší receptor - ligandový pár NKR-P1F a Clrg je důležitou součástí receptorového "zipu", který vzniká při kontaktu mezi NK buňkou a cílovou buňkou. Tento pár představuje jeden z příkladů nedávno objevených interakcí typu lektin-lektin, které jsou důležité při rozpoznání u mnoha imunocytů. Za účelem studia struktury těchto proteinů a jejich vzájemné interakce byly připraveny vektory pET-30a(+) pro bakteriální expresi. Tyto vektory kódovaly části extracelulárních domén obou proteinů. Po indukci IPTG byly proteiny produkovány ve formě inkluzních tělísek, ze kterých byly renaturovány in vitro. Renaturované proteiny byly purifikovány kombinací ionexové a gelové chromatografie. Konstrukt pro protein NKR-P1F poskytoval při použití standardních renaturačních protokolů pouze malé výtěžky solubilního proteinu, a navíc vyvstaly problémy s reprodukovatelností výsledků renaturace. V případě Clrg nebyly standardní postupy skládání úspěšné. Kvůli tomu bylo přistoupeno k mutaci lichého cysteinu, který nezapadal do obvyklého vzoru pro tyto receptory. Cystein byl mutován na serin a produkt výsledného C148S konstruktu již bylo možnorenaturovat in vitro. Dále bylo zjištěno, že přídavek (benzyldimethylamonnia)propansulfonátu do renaturačního pufru zvyšuje výtěžek solubilního...

Study of receptor-ligand pair NKR-P1F and Clrg Mouse NKR-P1F:Clr-g receptor:ligand pair is important component of the receptor "zipper" that occurs at the contact between natural killer cell and its target cell, and represents a recently discovered example of lectin-lectin interactions important for recognition among immune cell subsets. In order to study structure of these proteins and interactions between them, we have prepared pET-30a(+) bacterial expression vectors coding parts of extracellular domains of the two receptors. After induction of protein production with IPTG, the proteins precipitated into inclusion bodies, from which they could be refolded in vitro. Refolded proteins were purified using combination of ion exchange and size exclusion chromatography. NKR-P1F construct yielded only small amounts of soluble protein using standard refolding protocols. Furthermore we have experienced difficulties with reproducibility of the refolding results. In the case of Clrg the standard protocols for protein refolding were not sufficient. In order for the Clrg to fold properly, the odd cysteine which does not fit into the pattern usual for this family of receptors was substituted for serine and resulting C148S construct was shown to be more useful. Further, using (benzyldimethylammonio)propanesulfonate in...