Separace hepcidinu na magnetických sorbentech s následnou analýzou pomocí MALDI-TOF-MSí

Abstract

Hepcidin je peptid, který se tvoří v hepatocytech a který je sekretován do krevní plazmy a vylučován močí. Předpokládá se, že tento peptid hraje důležitou regulační úlohu v metabolismu železa a určení změn jeho hladiny v moči a krevním séru má význam pro diagnózu závažných onemocnění. Dosud popsané metody pro stanovení hepcidinu v moči a séru mají omezení a nelze je obecně používat. V současné době se pro konečnou analýzu hepcidinu používá MALDI-TOF MS. Před tímto závěrečným krokem je však nutná separace peptidu ze vzorků moči nebo séra. Předmětem diplomové práce bylo studium separačních metod, které by následně umožnily MALDI-TOF MS analýzu hepcidinu. V naší práci jsme použili magnetické sorbenty lišící se gelovou matricí a funkčními skupinami. Byly použity jednak komerční magnetické sorbenty obsahující -COOH skupiny a jednak hydrofilní polymetakrylátové mikročástice P(HEMA-co-GMA)-IDA s imobilizovanými kovovými ionty (připravené na Ústavu makromolekulární chemie AV ČR). Naše výsledky prokázaly, že pro adsorpci hepcidinu při pH 6,8 je možné použít komerční magnetické částice fluidMAG-CMX, SiMAG-Carboxyl a SiMAG-Silanol. Magnetické částice P(HEMA-co-GMA)-IDA s imobilizovanými měďnatými ionty jsou pro adsorpci standardu hepcidinu použitelné v širokém rozmezí pH, zatímco v případě imobilizovaných...

Hepcidin is cysteine-rich cationic peptide produced by hepatocytes, secreted into blood plasma, and excreted in urine. Hepcidin is proposed to be the key regulator of iron metabolism and an evaluation of changes in the hepcidin level is important for diagnosis of several diseases. However, methods used for the hepcidin detection and determination in urine and serum have certain limitations. At present time MALDI-TOF MS based approaches have been applied for final analysis of urinary and/or serum hepcidin levels. Before MS analysis, separation of hepcidin from analyzed samples is an important and necessary step. The aim of this study was to compare the ability of several magnetic sorbents with different coating matrix and/or different terminal functionalized groups to adsorb hepcidin prior MS analysis. Either commercial magnetic sorbents containing -COOH groups or magnetic hydrophilic IDA-modified polymethacrylate microparticles P(HEMA-co-GMA)-IDA with immobilized metal ions were use for this purpose. Hepcidin was adsorbed to magnetic sorbents containing linked carboxyl groups (i.e. to weak cation exchange magnetic particles) at pH 6.8 independently on a nature of magnetic particle coating layer. Magnetic particles P(HEMA-co- GMA)-IDA with immobilized Cu(II) ions were found to adsorb hepcidin in a...