Aplikace SPE a technologie monolitních kolon v HPLC analýze biologicky aktivních látek

Abstract

Extrakce na pevnou fázi (SPE) představuje účinnou, spolehlivou a selektivní moderní metodu pro úpravu vzorku biologického materiálu před chromatografickou analýzou. V diplomové práci byla vyvinuta nová metoda SPE pro izolaci vitaminu D2 (ergokalciferol), D3 (cholekalciferol) a metabolitu 25-(OH)D3 (kalcidiol) z lidského séra současně s vitaminy A (retinol) a E ( - tokoferol). Jednotlivé vitaminy byly následně stanoveny již vyvinutou a validovanou metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Vyvinutý postup SPE: Do skleněné zkumavky napipetujeme 250 l séra a přidáme 1000 l ethanolu o teplotě 4řC. Vzorek protřepeme a necháme 10 minut deproteinovat v chladničce při teplotě 4řC, poté zcentrifugujeme (4 000 x g, 15 minut, 4řC). Opatrně odebereme supernatant a naneseme na předem připravenou SPE kolonku (promytí 1 ml methanolu následně 1 ml destilované vody). Během těchto dvou kroků nesmí dojít k vyschnutí sorbentu kolonky. Vitamíny eluujeme 1,5 ml methanolu a následně 2 ml hexanu. Eluát odpaříme v koncentrátoru při teplotě 45řC. Odparek rozpustíme v 250 l methanolu a analyzujeme již vyvinutou HPLC metodou. Optimalizovaná HPLC metoda: Mobilní fáze - A: methanol:voda:2-propanol (75:15:10) 3,0 ml/min, 0.-3. minuta, B: methanol:voda (95:5) 3,5 ml/min, 3.- 6,5. minuta; kolona - monolitní kolona...

The solid phase extraction (SPE) is an effective, reliable and selective modern method for sample preparation of biological material before chromatographic analysis. In this graduation thesis the new SPE method for isolation of vitamin D2 (ergocalciferol), D3 (cholecalciferol) and its metabolite 25 - (OH) D3 (calcidiol) simultaneously with vitamin A (retinol) and E (α-tocopherol) in human serum was developed. The vitamins were subsequently determined by validated high performance liquid chromatography method (HPLC) using tocol as internal standard. The developed SPE procedure: Firstly 250 l of human serum was pipetted to glass tube and 1000 l of cool ethanol (4řC) was added. Sample was shaken and left 10 minutes in a refrigerator at 4řC for deproteinisation. After centrifugation (4 000 x g, 15 minutes, 4řC) all supernatant was carefully removed and applied into pre-treatment SPE column (firstly washed with 1 ml of methanol, then with 1 ml of distilled water). During these two steps the sorbent must not be dried up. The vitamins were eluted by 1.5 ml of methanol and then 2.0 ml of n-hexane. The organic solutions were evaporated in the vacuum concentrator at a temperature of 45 ř C. The residue was dissolved in 250 l of methanol and analyzed by using HPLC method. HPLC method: Mobile phase - A:...