Internalisation of anti-A?PP antibodies in cells.

Abstract

Úvod: Alzheimerova choroba (ACh) je specifickým typem demence s komplikovanou patologií. Za jednu z hlavních příčin Ach je považována tvorba extracelulárních nerozpustných fibril tvořených proteinem amyloid-beta (Aβ)vznikajícím z prekurzor-proteinu (AβPP) působením enzymů - sekretáz. Možnost ovlivnění činnosti β-sekretázy pomocí pasivní imunizace je v současné době testována jako možný způsob terapie ACh. Byla vyvinuta monoklonální protilátka nazvaná 2B12, která se prokazatelně váže na AβPP v blízkosti místa, kde dochází k jeho štěpení prostřednictvím β-sekretázy, a prostorovým stíněním zabraňuje štěpení AβPP a vzniku Aβ. 2B12 se na AβPP váže vně při povrchu buněk a celý vzniklý komplex se následně dostává do buňky, kde dochází k inhibici β-sekretázy. Metodologie: MOG buňky (původem nádorové hvězdicovité buňky) a H4 buňky (původem neurogliomy) byly při testování použity jako buněčný model ACh. Po inkubaci s 2B12, dalšími protilátkami vážícími se na AβPP (N-koncová protilátka) a protilátkami specificky se vážícími na jednotlivé buněčné organely za různých testovacích podmínek, buňky byly zafixovány a protilátky uvnitř označeny pomocí metod založených na principech imunologické buněčné chemie. To umožnilo jejich pozorování v jednotlivých buňkách prostřednictvím fluorescenčního mikroskopu. Výsledky: Prokázalo...

Introduction: Alzheimer disease (AD) is a specific type of dementia with a complex pathology. A formation of extracellular insoluble amyloid-beta (Aβ) fibrils from precursor protein (AβPP) has been identified as one of the main causes of AD. There are several enzymes involved in a production of Aβ; β-secretase has been recently considered as a potential target for AD treatment by methods of passive immunization. A monoclonal antibody (2B12) has been developed and proved that it binds in the vicinity of β-secretase cleavage site on AβPP and prevents the cleavage of AβPP by steric hindrance. 2B12 is known to binds to AβPP at the cell surface and the whole complex after internalization inhibits β- secretase activity. Methodology: The astrocytoma MOG-G-UVW (MOG) and the Human-CNS derived neuroglioma (H4) living cell lines were used as a model of AD. Incubated with 2B12, another AβPP - binding antibody (N-terminal) and several organelle markers (OM) under various conditions, the cells were fixed and stained by the method of sequential immunocytochemistry (ICC) and visualized using fluorescent microscope. Results: The experiments with MOG/H4 cells demonstrated that the intake of 2B12/N- terminal antibody into the cells is time-dependant; the best labelling was after 4 hours of incubation for 2B12 and MOG...