Optimalizace chromatografických podmínek pro HPLC stanovení vybraných karotenoidů

Abstract

Tato diplomová práce se zabývá hledáním optimálních podmínek pro stanovení karotenoidů luteinu, betakarotenu a zeaxanthinu. Pro stanovení byla využívána vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). V průběhu hledání optimálních podmínek bylo testováno velké množství kolon a různých mobilních fází. Vycházelo se přitom z poznatků publikovaných v odborné literatuře. Testována byla jak chromatografie na reverzních fázích, tak i chromatografie na normálních fázích. Nejčastěji testované byly C18 kolony od různých výrobců. Největším problémem pro HPLC stanovení a separaci těchto tří látek bylo to, že lutein a zeaxanthin jsou polohové izomery. Separace takovýchto látek je poměrně náročná a nepodařilo se ji zcela vyřešit. Přesto byla vyvinuta metoda, kterou je možno tyto tři látky separovat a stanovovat. Tato metoda využívá kolonu Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm), UV detekci při 450 nm, mobilní fázi methylenchlorid:hexan:acetonitril (2,5:2,5:95), dávkovaný objem vzorku 1 μl, rychlost průtoku mobilní fáze 1 ml/min při teplotě 30 řC, isokratický režim.

This thesis deals with searching for optimal conditions for determination of carotenoids lutein, betacarotene and zeaxanthin. High performance liquid chromatography - HPLC was used for determination. During searching for optimal conditions many various columns and mobile phases were tested. Primary information about carotenoids separation was obtained from scientific literature. There were tested both types of chromatography - normal phases chromatography and reversed phases chromatography. The most frequently tested columns were C18 columns from different producers. The biggest problem for HPLC determination and separation of these three substance were position isomers of lutein and zeaxanthin. Separation of these substances is relatively difficult and it wasn't completely solved in this thesis. In spite of it new metod for determination and separation of three carotenoids was developed. This method used isocratic elution at column Zorbax SB C18 (50 x 4,6 mm, 2 μm), UV detection at 450 nm, mobile phase of methylene chloride:hexan:acetonitrile (2,5:2,5:95), injected volume 1 μl and flow rate at 1 ml/min.