Separace žaludečních aspartátových proteas pomocí afinitní chromatografie

Abstract

Lidská žaludeční šťáva obsahuje zejména aspartátové proteasy - pepsin A a pepsin C. Oba pepsiny jsou produkovány v žaludeční sliznici jako inaktivní pepsinogeny (pepsinogen A a pepsinogen C), které se liší svými fyzikálněchemickými a imunologickými vlastnostmi. Oba pepsinogeny obsahují několik izozymogenů. K aktivaci pepsinogenů na příslušné pepsiny dochází v kyselém prostředí žaludku. (...) Téma dizertační práce je součástí projektu zabývajícího se zejména vypracováním metody pro separaci žaludečních aspartátových proteas, která by byla vhodná pro sledování jejich změn během zmíněných onemocnění. Dizertační práce se konkrétně zabývala přípravou vhodných afinitních sorbentů pro separaci pepsinů a pepsinogenů. Při výběru vhodného afinitního ligandu pro tyto proteasy jsme vycházeli ze známého substrátu N-acetyl-L-fenylalanyl- 3,5-dijod-L-tyrosinu, pomocí kterého lze stanovit aktivitu pepsinu A ve směsi s pepsinem C. Byly připraveny tři afinitní sorbenty: jodovaná L-tyrosin- Sepharosa, 3,5-dijod-L-tyrosin-Sepharosa a N-acetyl-L-fenylalanin-Sepharosa. Připravené sorbenty byly charakterizovány pomocí modelového enzymu (prasečího pepsinu A). Při studiu interakce prasečího pepsinu A a jeho komplexu s pepstatinem A s připravenými sorbenty bylo prokázáno, že se aktivní místo enzymu nepodílí na jeho interakci s...

Human gastric juice contains mainly aspartic proteases - pepsin A and pepsin C. Both pepsins are produced by gastric mucosa as inactive pepsinogens (pepsinogen A and pepsinogen C) that differ in their physico-chemical and immunological properties. Both pepsinogens consist of molecular variants, isozymogens. Pepsinogens are activated to the corresponding pepsins in the acidic environment of the gastric lumen. (...) A subject of this Ph.D. thesis is a part of a long-term investigation that focuses on the elaboration of methods for the separation of gastric aspartic proteases that would be suitable for monitoring of their changes in mentioned diseases. This thesis was mainly focused on preparation of affinity sorbents suitable for separation of pepsins and pepsinogens. The choice of ligands was based on the substrate N-acetyl-L-phenylalanyl-3,5-diiodo-L-tyrosine that is used to differentiate pepsin A and pepsin C. The following three affinity sorbents were prepared: iodinated L-tyrosine-Sepharose, 3,5-diiodo-L-tyrosine- Sepharose, and N-acetyl-L-phenylalanine-Sepharose. The basic characteristics of the prepared affinity sorbents were determined using the model enzyme (porcine pepsin A). The comparison of the chromatographic behavior of porcine pepsin A and its complex with pepstatine A showed that the enzyme...