Preparation and characterization of functionalized surfaces for desorption-ionization mass spectrometry

Abstract

Structural proteomics combined with mass spectrometry, is a rapidly evolving scientific discipline that focuses on the characterization of the three-dimensional structures of proteins, as well as their dynamics. However, Current standard practices require a large number of separate processing steps, especially when the structural data is obtained from the bottom-up approach. Moreover, these steps are mostly performed at different times and places. This doctoral thesis was aimed at preparation of MALDI mass spectrometry-compatible proteolytic biochips and their application in structural proteomics. These functionalized surfaces allow both the cleavage of the studied protein and the MALDI matrix crystallization followed by a mass spectrometric analysis to be performed within a single active position. An ion-landing technique operating under ambient conditions was revealed to be optimal for the immobilization of proteolytic enzymes. This electrospray-based technique enables a direct modification of flat, smooth and conductive surfaces which are also used in the MALDI ion source. Various serine and aspartic proteases were successfully immobilized to get a wide proteolytic substrate library available for various structural proteomics applications. A high number of active spots per biochip allowed us to...

Strukturní proteomika ve spojení s hmotnostní spektrometrií je rychle se rozvíjející vědecké odvětví, které se zabývá charakterizací trojrozměrných struktur proteinů, ale také jejich dynamiky. Současné standardní postupy vyžadují, zvláště v případech, kdy jsou strukturní data získávána analýzou peptidů, získaných proteolytickým štěpením studované molekuly, velké množství navzájem oddělených procesních kroků. Tato práce cílí na vývoj a přípravu proteolytických nosičů vhodných pro přímou analýzu za pomoci hmotnostního spektrometru s MALDI iontovým zdrojem a jejich využití v oblasti strukturní proteomiky. Tyto modifikované povrchy umožňují v rámci jedné aktivní pozice provést jak štěpení studovaného proteinu, tak i krystalizaci ionizační matrice a následnou hmotnostně-spektrometrickou analýzu. Technikou vhodnou pro modifikaci vodivých povrchů biologicky aktivními látkami se ukázala být měkká depozice iontů prováděná za atmosférického tlaku. Tato technika umožňuje pomocí elektrospreje modifikovat rovné, hladké a vodivé nosiče, tedy ty, které se využívají i v MALDI iontovém zdroji. Vysoké množství aktivních pozic na jednom čipu umožňuje současně testovat velké množství vzorků. Nízké pracovní objemy aplikovaného vzorku nebo činidla zhášejícího proteolytickou reakci přispívají k vysoké opakovatelnosti...