The importance of different sources and sequencing protocols in increasing the accuracy of NGS analysis in diagnostic applications

Abstract

1 Souhrn Neustálé pokroky v technologii sekvenování nové generace (NGS), jakými jsou kapacita, rychlost a snížené náklady na sekvenovaní, vedou k revoluci v personalizované medicíně, tím, jak postupně přináší genomiku do rutinní klinické praxe. NGS se stále rychle vyvíjí, avšak variabilita sekvenačních protokolů a validačních postupů je jedním z jeho problematických rysů. Cílem této práce bylo zhodnotit význam různých zdrojů vzorků a sekvenačních protokolů (od přípravy sekvenační knihovny-sekvenování-analýzi dat) pro zvýšení přesnosti NGS analýzy v diagnostických aplikacích. V první studii, provedené během vypuknutí pandemie COVID-19, jsme vyvinuli NGS protokoly vhodné pro analýzu celého genomu viru SARS-CoV-2. Následně jsme ve druhé studii zkoumali vhodnost lidské genomické DNA (gDNA) pocházející ze slin pro genomickou/genetickou analýzu vybraných variantních k tradiční gDNApocházející z krve pomocí validovaného NGS protokolu a statistického srovnání získaných dat. K ověření účinnosti sekvenačních protokolů pro analýzu celého genomu SARS-CoV-2 byly použity dva sekvenační přístupy založené na zachycení části genomu a jeden sekvenanční přístup založený na amplifikaci částí genomů. K ověření přesnosti a specifičnosti vyvinutých NGS protokolů byly použity syntetické kontroly. Prokázali jsme, že kvantifikace...

1 ABSTRACT Continued advances in next-generation sequencing (NGS) technology, such as capacity, speed, and reduced cost per sequenced base, revolutionize personalized medicine and bring genomics into routine clinical practice. Nevertheless, NGS is still under rapid development, and the variability of sequencing protocols and validation procedures is one of its current bottlenecks. This thesis aimed to study the influence of different sample sources and NGS protocols (NGS library construction-sequencing-data analysis) on the accuracy of NGS analysis in diagnostic applications. In the first study, performed during the COVID-19 pandemic outbreak, we developed NGS protocols suitable for a whole genome analysis of the SARS-CoV-2 virus. Subsequently, in the second study, we examined the suitability of human saliva-derived gDNA for genomic/genetic analysis of selected variant types compared to traditional blood-derived gDNAusing validated NGS protocol and statistical comparison of the obtained data. Whole genome analysis of the SARS-CoV-2 genome was performed using two captured- based approaches and one amplicon-based approach to study the quality and effectivity of the respective NGS protocols. Synthetic controls were employed to verify the accuracy and specificity of the developed NGS protocols. We proved that...