tRNA synthetases as potential RNA capping enzymes

Abstract

(CZ) V naší laboratoři byl nedávno objeven nový typ nekanonických RNA čepiček, obsahujících dinukleosid polyfosfáty. Abychom mohli objasnit jejich fyziologickou roli, je potřeba získat více informací o jejich syntéze v buňkách. Na základě nedávno publikovaných výsledků, dinukleosid polyfosfátové RNA (NpnN-RNA) mohou vznikat při transkripci přímou inkorporací dinukleosid polyfosfátů pomocí RNA polymerázy na počátek nově vznikajícího transkriptu (takzvaný nekanonický iniciační nukleotid). Nelze vyloučit i jiné možnosti syntézy NpnN čepičkované RNA, především jejich enzymatickou post-transkripční syntézu. Jedny z nejpravděpodobnějších kandidátů pro enzym vytvářející NpnN-RNA jsou aminoacyl-tRNA syntetázy. Tyto enzymy jsou, kromě své esenciální role v translaci, odpovědny za syntézu volných dinukleosid polyfosfátů v buňce. V této práci jsme vybrali čtyři tRNA syntetázy, klonovali je do plazmidů a purifikovali pomocí proteinové kapalinové chromatografie (fast protein liquid chromatography - FPLC). Následně byly tRNA syntetázy testovány pro syntézu volných dinukleosid polyfosfátů, díky čemuž jsme zjistili optimální reakční podmínky. Za daných reakčních podmínek jsme následně testovali, zda jsou tRNA syntetázy schopny vytvořit NpnN-RNA, a to pomocí reakce tRNA syntetáz s radioaktivně značenou RNA. Získané...

(EN) A novel type of non-canonical 5′ RNA caps, dinucleoside polyphosphate RNA caps, has recently been discovered in our laboratory. To elucidate the physiological role of these caps, more detailed information about their synthesis is essential. It has been already described that dinucleoside polyphosphate RNA caps (NpnN-RNA caps) can be accepted by RNA polymerase during transcription as a non-canonical initiating nucleotide (NCIN). However, the possibility that NpnN-RNA caps are created post- transcriptionally cannot be ruled out. The best candidates for post-transcriptional capping enzymes are aminoacyl-tRNA synthetases, which, besides their crucial role in translation, are responsible for the synthesis of free dinucleoside polyphosphates. In this thesis, four E. coli tRNA synthetases have been selected, cloned into plasmids, and purified using fast protein liquid chromatography (FPLC). Subsequently, selected tRNA synthetases have been tested for the production of free dinucleoside polyphosphate. These experiments have identified the optimal conditions for production of free dinucleoside polyphosphates, diadenosine tetraphosphate (Ap4A) particularly. The tRNA synthetases were then tested for their capabilities to form an RNA cap on in vitro transcribed radioactively labelled RNA. We found that...