Show simple item record

Exprese a purifikace proteinů s nepřirozenými aminokyselinami a studium jejich struktury pomocí chemické nebo fotochemické modifikace a hmotnostní spektrometrie
dc.contributor.advisorJečmen, Tomáš
dc.creatorBortel, Tomáš
dc.date.accessioned2023-11-06T12:08:50Z
dc.date.available2023-11-06T12:08:50Z
dc.date.issued2023
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/20.500.11956/185140
dc.description.abstractResidue-specific non-natural amino acid (NNAA) incorporation has become a widely used approach to introduce bioorthogonal groups and therefore functionalities into proteins26 . These functionalities are harnessed through click chemistry, conjugating labelled proteins to affinity or fluorescent probes. A less utilized approach involves probing the effects of bioorthogonal groups on the structure-function relationship of labelled proteins47 . In order to investigate these relationships, there is a need to express large amounts of proteins with maximal incorporation of NNAAs. Here, we employed photo-methionine (pMet), azidohomoalanine (AHA) and homopropargylglycine (HPG) as methionine (Met) surrogates. We investigated the impact of these NNAAs on bacterial growth of prototrophic E. coli BL21 or Met- -auxotrophic E. coli B834 in Met-free MM-M9 medium. We monitored the expression of cytochrome b5 (cyt b5) and MBP-GFP. Using MS and LC-MS based approaches, we determined the NNAA incorporation in these recombinant proteins. Prototrophic E. coli BL21 expressed significantly higher amounts of cyt b5 compared to B834 with pMet and AHA, but the incorporation rates fell sharply after 4 hours. In contrast, Met-auxotrophic B834 expressed smaller amounts of protein, but with incorporation of pMet in 50 - 70% range...en_US
dc.description.abstractInkorporace nepřirozených aminokyselin (NNAA) je široce používaný způsob pro zavedení bioorthogonálních funkčních skupin do proteinů26 . Tyto funkční skupiny lze využít použitím click chemie, konjugací značených proteinů na afinitní nebo fluorescenční sondy. Méně rozšířené využití NNAA zahrnuje výzkum vlivu bioorthogonálních funkčních skupin na strukturně - funkční vztahy v značených proteinech47 . Pro výzkum těchto vztahů je zapotřebí exprimovat velké množství proteinu s maximální inkorporací NNAA. V naší práci jsme nahrazovali methionin (Met) třemi NNAA: foto-methioninem (pMet), azidohomoalaninem (AHA) a homopropargylglycinem (HPG). Zkoumali jsme vliv těchto NNAA na růst prototrofních E. coli BL21 a Met-auxotrofních E. coli B834 v MM- -M9 médiu. Sledovali jsme expresi cytochromu b5 a MBP-GFP. Pro určení míry inkorporace jednotlivých NNAA do těchto rekombinantních proteinů jsme použili MALDI-ToF MS a LC-MS. V porovnání s Met-auxotrofními E.coli B834, prototrofické E. coli BL21 exprimovaly výrazně vyšší množství cytochromu b5 s pMet a AHA, avšak s nízkými inkorporacemi těchto NNAA. Situace byla opačná v B834, které exprimovaly výrazně nižší množství proteinu, avšak s inkorporací pMet od 50 - 70 % a AHA kolem 50 %. Oba bakteriální kmeny s HPG exprimovaly podobné množství cytochromu b5 s...cs_CZ
dc.languageEnglishcs_CZ
dc.language.isoen_US
dc.publisherUniverzita Karlova, Přírodovědecká fakultacs_CZ
dc.subjectnepřirozené aminokyselinycs_CZ
dc.subjectmodifikace proteinůcs_CZ
dc.subjecthmotnostní spektrometriecs_CZ
dc.subjectunnatural aminoacidsen_US
dc.subjectprotein modificationen_US
dc.subjectmass spectrometryen_US
dc.titleExpression and purification of proteins with unnatural aminoacids, and determination of their structure by combination of chemical or photochemical modification and mass spectrometryen_US
dc.typediplomová prácecs_CZ
dcterms.created2023
dcterms.dateAccepted2023-09-12
dc.description.departmentKatedra biochemiecs_CZ
dc.description.departmentDepartment of Biochemistryen_US
dc.description.facultyPřírodovědecká fakultacs_CZ
dc.description.facultyFaculty of Scienceen_US
dc.identifier.repId230563
dc.title.translatedExprese a purifikace proteinů s nepřirozenými aminokyselinami a studium jejich struktury pomocí chemické nebo fotochemické modifikace a hmotnostní spektrometriecs_CZ
dc.contributor.refereeKavan, Daniel
thesis.degree.nameMgr.
thesis.degree.levelnavazující magisterskécs_CZ
thesis.degree.disciplineBiochemiecs_CZ
thesis.degree.disciplineBiochemistryen_US
thesis.degree.programBiochemiecs_CZ
thesis.degree.programBiochemistryen_US
uk.thesis.typediplomová prácecs_CZ
uk.taxonomy.organization-csPřírodovědecká fakulta::Katedra biochemiecs_CZ
uk.taxonomy.organization-enFaculty of Science::Department of Biochemistryen_US
uk.faculty-name.csPřírodovědecká fakultacs_CZ
uk.faculty-name.enFaculty of Scienceen_US
uk.faculty-abbr.csPřFcs_CZ
uk.degree-discipline.csBiochemiecs_CZ
uk.degree-discipline.enBiochemistryen_US
uk.degree-program.csBiochemiecs_CZ
uk.degree-program.enBiochemistryen_US
thesis.grade.csVelmi dobřecs_CZ
thesis.grade.enVery gooden_US
uk.abstract.csInkorporace nepřirozených aminokyselin (NNAA) je široce používaný způsob pro zavedení bioorthogonálních funkčních skupin do proteinů26 . Tyto funkční skupiny lze využít použitím click chemie, konjugací značených proteinů na afinitní nebo fluorescenční sondy. Méně rozšířené využití NNAA zahrnuje výzkum vlivu bioorthogonálních funkčních skupin na strukturně - funkční vztahy v značených proteinech47 . Pro výzkum těchto vztahů je zapotřebí exprimovat velké množství proteinu s maximální inkorporací NNAA. V naší práci jsme nahrazovali methionin (Met) třemi NNAA: foto-methioninem (pMet), azidohomoalaninem (AHA) a homopropargylglycinem (HPG). Zkoumali jsme vliv těchto NNAA na růst prototrofních E. coli BL21 a Met-auxotrofních E. coli B834 v MM- -M9 médiu. Sledovali jsme expresi cytochromu b5 a MBP-GFP. Pro určení míry inkorporace jednotlivých NNAA do těchto rekombinantních proteinů jsme použili MALDI-ToF MS a LC-MS. V porovnání s Met-auxotrofními E.coli B834, prototrofické E. coli BL21 exprimovaly výrazně vyšší množství cytochromu b5 s pMet a AHA, avšak s nízkými inkorporacemi těchto NNAA. Situace byla opačná v B834, které exprimovaly výrazně nižší množství proteinu, avšak s inkorporací pMet od 50 - 70 % a AHA kolem 50 %. Oba bakteriální kmeny s HPG exprimovaly podobné množství cytochromu b5 s...cs_CZ
uk.abstract.enResidue-specific non-natural amino acid (NNAA) incorporation has become a widely used approach to introduce bioorthogonal groups and therefore functionalities into proteins26 . These functionalities are harnessed through click chemistry, conjugating labelled proteins to affinity or fluorescent probes. A less utilized approach involves probing the effects of bioorthogonal groups on the structure-function relationship of labelled proteins47 . In order to investigate these relationships, there is a need to express large amounts of proteins with maximal incorporation of NNAAs. Here, we employed photo-methionine (pMet), azidohomoalanine (AHA) and homopropargylglycine (HPG) as methionine (Met) surrogates. We investigated the impact of these NNAAs on bacterial growth of prototrophic E. coli BL21 or Met- -auxotrophic E. coli B834 in Met-free MM-M9 medium. We monitored the expression of cytochrome b5 (cyt b5) and MBP-GFP. Using MS and LC-MS based approaches, we determined the NNAA incorporation in these recombinant proteins. Prototrophic E. coli BL21 expressed significantly higher amounts of cyt b5 compared to B834 with pMet and AHA, but the incorporation rates fell sharply after 4 hours. In contrast, Met-auxotrophic B834 expressed smaller amounts of protein, but with incorporation of pMet in 50 - 70% range...en_US
uk.file-availabilityV
uk.grantorUniverzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemiecs_CZ
thesis.grade.code2
uk.publication-placePrahacs_CZ
uk.thesis.defenceStatusO


Files in this item

Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail
Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record


© 2017 Univerzita Karlova, Ústřední knihovna, Ovocný trh 560/5, 116 36 Praha 1; email: admin-repozitar [at] cuni.cz

Za dodržení všech ustanovení autorského zákona jsou zodpovědné jednotlivé složky Univerzity Karlovy. / Each constituent part of Charles University is responsible for adherence to all provisions of the copyright law.

Upozornění / Notice: Získané informace nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora. / Any retrieved information shall not be used for any commercial purposes or claimed as results of studying, scientific or any other creative activities of any person other than the author.

DSpace software copyright © 2002-2015  DuraSpace
Theme by 
@mire NV