Analýza aktivního místa rutinosidasy z Aspergillus niger a jeho mutageneze

Abstract

Rutinosidases (α-L-rhamnosyl-β-D-glucosidases) from Aspergillus niger (AnRut) are glycosidases (EC 3.2.1) that catalyze the hydrolysis of the glycosidic bond between the aglycone and the disaccharide residue rutinose. The dual substrate specificity of this enzyme group describes the parallel activity towards the substrates rutin (carrying a rutinosyl disaccharide residue) and isoquercitrin (carrying a glucosyl residue). The active site of AnRut is more complex than that of other glycosidases and is composed of the catalytic amino acids Glu210 and Glu319 in the active-site cleft and a side tunnel. This untraditional structure with distinct interactions in the tunnel and active-site cleft is the probable reason for the enzyme exceptional substrate specificity. Through point or multiple mutations of the enzyme, we can modify its primary and secondary structure, thus causing a significant shift in substrate specificity. The main goal of this thesis is the analysis of three distinct mutant variants of AnRut rutinosidase; their production, purification, and the study of the influence of the mutations on the substrate specificity of the enzymes. All variants were designed based on molecular modeling. The substrate specificity was determined by reactions of the mutant variants with previously unstudied...

Rutinosidasy (α-L-rhamnosyl-β-D-glukosidasy) z Aspergillus niger (AnRut) jsou glykosidasy (EC 3.2.1) katalyzující hydrolýzu glykosidové vazby mezi aglykonem a disacharidovým zbytkem rutinosou. Duální substrátová specifita této skupiny enzymů popisuje paralelní aktivitu k substrátům rutinu (nesoucímu disacharidový zbytek rutinosyl) a isokvercitrinu (nesoucímu glukosyl). Aktivní místo AnRut je komplexnější než u ostatních glykosidas a je tvořeno katalytickými aminokyselinami Glu210 a Glu319 v aktivním místě a postranním tunelem - tato netradiční struktura s rozdílnými interakcemi v tunelu a aktivním místě je pravděpodobně důvodem výjimečné substrátové specifity enzymu. Bodovou či vícenásobnou mutací enzymu můžeme modifikovat jeho primární i sekundární strukturu, a tím způsobit i výrazný posun substrátové specifity. Hlavním cílem této práce je analýza tří rozdílných mutantních variant rutinosidasy AnRut, jejich produkce, purifikace a studie vlivu mutací v těchto variantách na substrátovou specifitu enzymů. Všechny varianty byly navrženy na základě molekulárního modelování. Substrátová specifita byla mj. stanovena reakcemi mutantních variant s dosud neprostudovanými substráty. Pomocí HPLC byla také stanovena afinita jednotlivých variant k přirozeným substrátům rutinu a isokvercitrinu. Klíčová slova...