Identification and characterization of ciliary tip proteins

Abstract

The distal tip of the cilium/flagellum, also known as the ciliary tip domain (CTD), is critical for the structure and function of the eukaryotic cilium. The limited knowledge of its protein constituents hinders a better understanding of the domain. In this thesis, we set out to verify the localization of a subset of known mammalian CTD constituents and to assess the localization of candidate CTD proteins, orthologs of which localize to the tip of the flagellum of evolutionary distant protozoan Trypanosoma brucei. Using our localization pipeline, we identified two proteins that robustly localize to the CTD of the primary cilium. One of these proteins (ZC2HC1C), in addition, also localizes to stationary foci along the axoneme, positions of which coincide with sites of intraflagellar train pausing and turning. We hypothesize that these may be ends of sub-distally terminating axonemal microtubules. We further show that the protein ULK4 localizes to the CTD of motile ependymal cilia but not to the CTD of primary cilia, consistent with previously published phenotypes in ULK4 depleted mice and exemplifying differences in the composition of CTDs of the two types of cilia. Finally, we demonstrate that Expansion microscopy, a rapid and robust super-resolution technique, is well suited for ultrastructural and...

Distální konec řasinky/bičíku, také známý jako doména ciliární špičky (CTD), je nepostradatelná pro strukturu a funkci eukaryotických řasinek. Lepšímu porozumění této domény brání nedostatečné znalosti jejích proteinových komponentů. Cílem dizertační práce bylo ověřit lokalizaci vybraných známých proteinů CTD savčích řasinek, a testovat lokalizaci kandidátních CTD proteinů, jejichž ortology se nacházejí na špičce bičíku evolučne vzdáleného prvoka Trypanosoma brucei. Pomocí našeho lokalizačního postupu jsme identifikovali dva proteiny, které výrazně lokalizují do CTD primární řasinky. Jeden z těchto proteinů, ZC2HC1C, navíc také lokalizuje do stacionárních bodů podél axonemy, jejichž pozice se shodují s místy zastavení a otáčení intraflagelárních vlaků. Předpokládáme, že se může jednat o konce sub-distálně končících axonemalních mikrotubulů. Dále prokazujeme, že protein ULK4 lokalizuje do CTD pohyblivých ependymálních řasinek, ale ne do CTD primárnich řasinek, což je v souladu s dříve publikovanými fenotypy u ULK4 knock- outových myší a dokládá rozdíly ve složení CTD těchto dvou typů řasinek. Nakonec jsme ukázali, že Expanzní mikroskopie je rychlá a robustní super-rezoluční metoda, vhodná pro ultrastrukturální a lokalizační studie CTD savčích řasinek a bičíků T. brucei.