Analýza vlivu mutací v genu pro nukleofosmin na jeho interakční potenciál

Abstract

Nucleophosmin 1 (NPM1) is predominantly localized in the nucleolus and occurs mainly in oligomers formed through its N-terminal domain (NTD). As a transport facilitator and chaperone, NPM1 has a wide range of interacting partners including tumor suppressors p53 and p14Arf. Characteristic C-terminal mutations in NPM1 are reported in approximately 30 % of acute myeloid leukemia (AML) cases and cause aberrant cytoplasmic localization of mutated (mut) NPM1. As a result, many NPM1-interacting proteins, including wild type (wt) NPM1, are relocalized to the cytoplasm. In order to analyze interactions and the oligomeric state of NPM1, we have introduced and optimized several in vitro techniques - native and semi-native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoprecipitation - as well as in vivo confocal microscopy and time-resolved fluorescence approaches. Using these methods, we revealed that mutations at the C-terminal domain of NPM1 prevent it from binding nucleolar protein nucleolin (NCL), which has previously been shown to interact with the central part of NPM1, and that drug-induced relocation of mutNPM1 to close proximity of NCL does not induce mutNPM1-NCL complex formation. We proved a lowered stability of mutNPM1-formed oligomers as compared to the wtNPM1 ones, which could be useful for NPM1...

Nukleofosmin 1 (NPM1; nucleophosmin 1) se v buňce vyskytuje převážně v jadérku, ve formě oligomerů tvořených skrze N-koncovou doménu (NTD; N-terminal domain), a jako molekulární chaperon a transportní protein má široké spektrum interakčních partnerů včetně p53 či p14Arf. Mutace v C-koncové oblasti NPM1 je prokazována asi u 30 % pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML; acute myeloid leukemia) a projevuje se aberantní expresí mutovaného (mut; mutated) NPM1 v cytoplazmě. V důsledku toho dochází v leukemických buňkách s mutNPM1 k přesunu mnoha proteinů s ním interagujících, včetně jeho přirozené formy (wt; wild-type), do cytoplazmy. Pro detekci interakcí a oligomerních komplexů NPM1 jsme zavedli a optimalizovali jak in vitro techniky - nativní a seminativní gelovou elektroforézu a imunoprecipitaci, tak testování in vivo - konfokální mikroskopii a metody časově rozlišené fluorescence. Těmito metodami jsme prokázali, že v důsledku C-terminální mutace NPM1 dochází k narušení jeho interakce s jadérkovým proteinem nukleolinem (NCL; nucleolin), která se tvoří mimo NTD, a že komplex mutNPM1-NCL nevzniká ani po ošetření buněk cytotoxickými léčivy navozujícími relokalizaci obou partnerů do stejného buněčného kompartmentu. V naší studii dále ukazujeme, že oligomery mutNPM1 jsou méně stabilní než oligomery...