New molecular mechanisms involved in cell cycle control

Abstract

Cecilia Aquino Perez, M. Sc. Doctoral thesis abstract In this doctoral, thesis we aimed to find and study novel mechanisms regulating cell cycle phase transitions in non-stressed conditions and in context of the cell response to various types of stress. First, we focused on studying Polo-like kinase 3 that has previously been implicated in activation of the cell cycle checkpoint after DNA damage. For this, we employed CRISPR/Cas9- mediated gene editing to knock-out PLK3 in RPE cells while in parallel performing RNA interference assays and submitting the cells to different types of stress. The main observation was that in both systems PLK3 was disposable for response to DNA damage, hypoxia and osmotic stress. Through mass spectrometry analysis of purified EGFP-PLK3 we identified PP6 and its regulatory subunits PPP6R1 and PPP6R3 as novel PLK3 interactors. We observed that PLK3 is phosphorylated in its conserved residue Thr-219 and that PP6 depletion boosted PLK3 phosphorylation status but did not affect its kinase activity. The possible regulation of PLK3 trough PP6 is interesting and its biological relevance will be addressed by future research. Next, we performed a transcriptomic analysis in human RPE-FUCCI cells aiming to identify new regulators of the cell cycle. We selected Family with sequence...

Cecilia Aquino Perez, M. Sc. Abstrakt doktorské disertační práce V této doktorské práci jsme se zaměřili na nalezení a pochopení nových mechanismů řídících buněčný cyklus v normálních podmínkách i v kontextu buněčné odpovědi na různé formy stresu. Nejdříve jsme se zaměřili na studium Polo-like kinázy 3, která byla již dříve popsána v aktivaci kontrolních bodů cyklu v důsledku poškození DNA. Pomocí technologie CRISPR/Cas9 jsme cíleně inaktivovali gen PLK3 v lidských RPE buňkách a paralelně rovněž potlačili expresi PLK3 pomocí RNA interference. Hlavním pozorováním bylo zjištění, že PLK3 není nezbytná pro kontrolu buněčné odpovědi na poškození DNA, hypoxii a osmotický stres. Metodou hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali fosfatázu PP6 a její regulační podjednotky PPP6R1 a PPP6R3 jako nové interakční partnery PLK3. Dále jsme pozorovali, že PLK3 je fosforylována na konzervovaném zbytku Thr219 a že deplece PP6 zvyšuje úroveň fosforylace PLK3 ovšem bez vlivu na její enzymatickou aktivitu. Tyto výsledky naznačují možnou regulaci funkce PLK3 prostřednictvím PP6 a biologická relevance tohoto pozorování bude předmětem dalšího studia. Dále jsme provedli transkriptomovou analýzu v lidských RPE-FUCCI buňkách s cílem nalézt potencionální nové regulátory buněčného cyklu. V dalším studiu jsme se zaměřili na Family...