Příprava afinitních povrchů pro hmotnostní spektrometrii

Abstract

Jednou z nejvíce účinných toxických substancí biologického původu známých lidstvu jsou botulotoxiny, nervové jedy produkované bakteriemi rodu Clostridium. Místem jejich účinku jsou nervosvalová zapojení, ve kterých štěpí proteiny SNARE komplexu, čímž zamezí uvolnění neurotransmiteru a přenosu nervového vzruchu. Výsledkem je ochablá paralýza, hlavní symptom onemocnění zvaného botulismus. Kvůli nízké smrtelné dávce a vysoké toxicitě mají BoNTs své místo na seznamu činitelů bioterorismu. I když je dnes k dispozici mnoho metod jejich detekce, "zlatým standardem" jsou dosud biologické testy na myších. Nehledě na etickou stránku těchto experimentů, značnou nevýhodou je i jejich časová náročnost. V této práci je představeno unikátní spojení proteinových povrchů s metodou využívající k detekci aktivních BoNTs jejich endopeptidasovou aktivitu a hmotnostní spektrometrii, EndoPep-MS. Funkcionalizované povrchy byly připraveny metodou měkkého přistávání iontů za atmosférického tlaku, která využívá proud hypertermálních iontů (rozsah energie 1-100 eV), čím umožňuje kontrolovanou modifikaci. Botulotoxin A1 byl detekován dvěma způsoby. První byl založen na interakci avidin-biotin, kdy byly na neutravidinem modifikovaném povrchu nabohaceny biotinem značené peptidy (substrátový peptid pro BoNT/A i peptidové produkty...

One of the most potent toxic substances of biological origin known are botulinum toxins - nerve toxins produced by strains of Clostridium bacteria. They affect neuro-muscular connections where they cleave proteins of the SNARE complex, block neurotransmitter release, and thus stop signal transmission. This leads to flaccid paralysis, the main symptom of a disease called botulism. Due to their extremely low lethal dose and high toxicity, BoNTs take a place on the list of agents of bioterrorism. Despite numerous methods available to this date, the mouse bioassay remains the gold standard for the detection of BoNTs. Regardless of the ethical aspects of these experiments, the time they require is also inconvenient. In this work, a unique combination of protein surfaces and detection of active BoNTs through their endopeptidase activity and mass spectrometry, EndoPep-MS, is introduced. Functionalized surfaces were prepared by ambient ion soft landing - a technique utilizing a beam of hyperthermal ions (energy range 1-100 eV) as a tool for controlled modification. Two approaches to the detection of botulinum toxin A1 were applied. One of them, based on avidin- biotin interaction, used a neutravidin-modified surface for enhancement of biotinylated peptides (substrate peptide for BoNT/A and peptide products...