Separace IgG glykopeptidu pomocí hydrofilní interakční/iontově výměnné kapalinové chromatografie

Abstract

Glykoproteomika je náročným odvětvím proteomiky, a to zejména kvůli mikro- a makroheterogenitě proteinové glykosylace. Hydrofilní interakční kapalinovou chromatografii (HILIC) lze využít pro separaci glykopeptidů před jejich identifikací pomocí hmotnostní spektrometrie. Jedná se o výhodnou alternativu ke kapalinové chromatografii na reverzní fázi, která se pro tento typ separace běžně využívá. V současnosti existuje řada komerčně dostupných HILIC kolon lišících se v chemické struktuře stacionární fáze. Zároveň však není publikován dostatek srovnávacích studií, na základě kterých by bylo možné vybrat adekvátní stacionární fázi pro různé glykoproteomické aplikace. V této diplomové práci byly porovnávány tři HILIC kolony od výrobce Advanced Chromatography Technologies (ACE): kolona HILIC-A se silikagelovou stacionární fází, kolona HILIC-N s polyhydroxylovou stacionární fází na bázi silikagelu a kolona HILIC-B s aminopropylovou stacionární fází na bázi silikagelu. Zároveň bylo provedeno srovnání těchto kolon s oktadecylovou reverzní stacionární fází. Kolony HILIC-A a HILIC-B jsou schopny pracovat ve smíšeném retenčním módu, který kombinuje hydrofilní a iontově výměnné interakce. Dle očekávání, reverzní fáze odseparovala klastry glykopeptidů imunoglobulinu G1 a imunoglobulinu G2, které se lišily v...

Glycoproteomics is a challenging branch of proteomics because of the micro- and macro-heterogeneity of protein glycosylation. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) is an advantageous alternative to reversed-phase chromatography for intact glycopeptide separation prior to their identification by mass spectrometry. Nowadays, several HILIC columns differing in used chemistries are commercially available. However, there is a lack of comparative studies assessing their performance, and thus providing guidance for the selection of an adequate stationary phase for different glycoproteomics applications. Here, we compare three HILIC columns recently developed by Advanced Chromatography Technologies (ACE) with unfunctionalized (HILIC-A), polyhydroxy functionalized (HILIC-N), and aminopropyl functionalized (HILIC-B) silica with a C18 reversed phase column in the separation of human immunoglobulin G glycopeptides. HILIC-A and HILIC-B exhibit mixed-mode separation combining hydrophilic and ion-exchange interactions for analyte retention. Expectably, reversed-phase mode successfully separated clusters of immunoglobulin G1 and immunoglobulin G2 glycopeptides, which differ in amino acid sequence, but was not able to adequately separate different glycoforms of the same peptide. All ACE HILIC...