Identification of novel substrates of PKN3 kinase and characterization of the role of phosphorylation in the regulation of Rho GAP activity

Abstract

Proteínová fosforylácia predstavuje jednu z najdôležitejších posttranslačných modifikácií v signálnom prenose a zohráva kľúčovú úlohu v regulácii väčšiny bunkových procesov, vrátane bunkového cyklu, komunikácie s extracelulárnym prostredím, bunkovej migrácie, alebo apoptózy. Fosforylácia je sprostredkovaná kinázami, deregulácia ktorých často negatívne ovplyvňuje vývoj a celkovú homeostázu a vedie k vzniku viacerých druhov ochorení, vrátane rakoviny. V tejto práci sme sa zamerali na identifikáciu nových substrátov kinázy PKN3, ktorá je známym regulátorom organizácie cytoskeletu a pro-malígneho rastu nádorov. Za použitia analóg-senzitívnej mutácie PKN3 sme urobili fosfoproteomický screen a identifikovali sme 281 proteínov, ktoré by potenciálne mohli byť fosforylované kinázou PKN3. Spomedzi týchto proteínov sme pre ďalší výskum vybrali ARHGAP18 z rodiny Rho GAP proteínov. Potvrdili sme, že PKN3 je schopná fosforylovať ARHGAP18 na Thr154, Ser156 a Thr158, a že tieto proteíny sú schopné vzájomnej interakcie v závislosti na izoforme ARHGAP18. Ďalej sme ukázali, že zámena týchto troch miest za fosfomimikujúci aspartát viedla k aktivácii GAP domény ARHGAP18, výsledkom čoho došlo k zníženiu hladiny aktívneho RhoA naznačujúc možnú existenciu negatívnej spätnej väzby v regulácii RhoA signalizácie. V druhej...

Protein phosphorylation represents one of the most important posttranslational modifications in signal transduction and plays a crucial role in regulation of most of the cellular processes including cell cycle, communication with extracellular environment, cell migration or apoptosis. Phosphorylation is mediated by protein kinases, deregulation of which often negatively affects development and overall homeostasis and leads to development of several diseases, including cancer. In the first part of this work we focused on identification of new substrates of PKN3 kinase, which is a known player in regulation of cytoskeletal organization and pro-malignant tumor growth. Using an analog-sensitive mutant of PKN3 we performed a phosphoproteomic screen and identified 281 proteins that could potentially be phosphorylated by PKN3. Among these, we selected ARHGAP18, a protein from Rho GAP family, for further study. We confirmed PKN3 is able to phosphorylate ARHGAP18 on Thr154, Ser156 and Thr158 and that the two proteins are able to interact with one another in an ARHGAP18 isoform-specific manner. We further showed that substitution of the three candidate sites for phosphomimicking aspartate led to the activation of ARHGAP18 GAP domain which resulted in decreased levels of active RhoA, suggesting the existence...