Enzymatic synthesis of DNA modified in the minor groove

Abstract

In the first part of the thesis, a series of six modified 2'-deoxyadenosine triphosphates, bearing small functional groups (chloro, amino, methyl, vinyl, ethynyl and phenyl) at position 2 of adenine, was designed and synthesised. They were then tested as substrates for DNA polymerases in enzymatic synthesis of minor-groove modified DNA. The 2-phenyl modified dATP was the only triphosphate unable to be incorporated, meaning that the phenyl group is already too big for minor-groove incorporations. All of the other tested nucleotides were good substrates for tested DNA polymerases [KOD XL, Vent(exo-) and Bst LF] affording minor- groove modified DNA bearing one or four modifications. The vinyl- and ethynyl-modified DNAs were then used for post-synthetic modification of DNA minor groove with fluorescent labels utilising click reactions. Ethynyl group reacted in copper-catalysed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC), whereas the vinyl group participated in thiol-ene reaction. This procedure allowed for the attachment of big functional groups otherwise unable to be installed into the DNA minor groove using direct enzymatic incorporation. The second part of the thesis was devoted to the study of 2-alkylamino-2'- deoxyadenosine triphosphates and their use in enzymatic synthesis of base-modified ONs and DNA....

Souhrn V první části práce byla navržena a syntetizována řada šesti modifikovaných 2'- deoxyadenosintrifosfátů, nesoucí malé funkční skupiny (chlor, amino, methyl, vinyl, ethynyl a fenyl) na adeninu v poloze 2. Připravené nukleotidy byly testovány jako substráty pro DNA polymerázy v enzymatické syntéze DNA modifikované v malém žlábku. 2-Fenyl modifikovaný dATP byl jediným trifosfátem, který nebyl inkorporovaný, což znamená, že fenylová skupina je již příliš velká pro inkorporaci do malého žlábku. Všechny ostatní testované nukleotidy byly dobrými substráty pro testované DNA polymerázy [KOD XL, Vent(exo-) a Bst LF], což poskytlo modifikovanou DNA s malým žlábkem nesoucím jednu nebo čtyři modifikace. Modifikované DNA s vinylovou nebo ethynylovou skupinou byly poté použity pro modifikaci malého žlábku DNA fluorescenčními značkami za použití click reakcí. Ethynylová skupina reagovala v mědí katalyzované cykloadici alkynu s azidem (CuAAC), zatímco vinylová skupina se účastnila thiol- en-ové reakce. Tento postup umožnil připojení velkých funkčních skupin, které by jinak nemohly být instalovány do malého žlábku DNA pomocí přímé enzymatické inkorporace. Druhá část práce byla věnována studiu 2-alkylamino-2'-deoxyadenosin trifosfátů a jejich použití v enzymatické syntéze modifikovaných oligonukleotidů a DNA. N2 -alkyl...