Optimalizace analýzy lipopeptidů pomocí kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie

Abstract

Modifikace proteinů lipidovou strukturou je poměrně běžná post-translační modifikace, která ovlivňuje vlastnosti proteinů a má přímý vliv na vazbu modifikovaných proteinů do buněčných membrán. Některé lipidované proteiny hrají roli v různých patologických procesech. Při proteomické analýze těchto proteinů je zkoumaný vzorek nejprve naštěpen pomocí proteázy. Vzniklý hydrolyzát obsahuje jak nemodifikované peptidy, tak i peptidy nesoucí lipidovou modifikaci. Při následné chromatografické separaci se lipopeptidy od těch nemodifikovaných výrazně liší svým chováním. Z tohoto důvodu je analýza lipopeptidů, potažmo lipoproteinů, z hlediska separace a detekce problematická. Předmětem této diplomové práce byla optimalizace analýzy lipoproteinů pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí. Postupy byly testovány na lipoproteinech Cya A (bifunkční adenylát-cyklázový toxin baterie Bordetella pertussis) a MMTV (matrixový protein viru myšího tumoru prsních žláz). Nejprve byly testovány různé postupy přípravy vzorků zahrnující proteolytické štěpení. Při enzymatickém štěpení trypsinem na filtru (eFASP) došlo k zachycení lipidové modifikace s vysokou mírou spolehlivosti. V dalším kroku bylo testováno nastavení gradientové eluce pro chromatografickou metodu. Jako vhodný byl zvolen gradient dlouhý 70 minut...

Modification of proteins by lipid structure is relatively common post-translational modification that affects the properties of proteins directly and has a forthright effect on the binding of modified proteins to cell membranes. Some lipoproteins play key role in various pathological processes. Before the proteomic analysis of these proteins, the sample of interest is digested using a protease. The resulting hydrolysate contains both unmodified peptides and peptides bearing a lipid modification. During the subsequent chromatographic separation, the lipopeptides differ significantly from the unmodified peptides. For this reason, the analysis of lipopeptides, lipoproteins respectively, is problematic in terms of separation and detection. The subject of the study of this diploma thesis was the optimization of the method of lipoprotein analysis using liquid chromatography and mass spectrometry. The procedures were tested on lipoprotein Cya A (bifunctional adenylate-cyclase toxin from Bordetella pertussis) and MMTV (matrix protein of mouse mammary tumour virus). First, various sample preparation procedures involving proteolytic cleavage were tested. When enzymatic digestion using trypsin on filter (eFASP) was used, the lipid modification was detected with high degree of reliability. In the next step,...