Příprava syntetických modifikovaných messenger RNA genů kódující regulátory buněčného cyklu

Abstract

One of the modern therapeutic approaches is the application of in vitro transcribed mRNA into the target cells to produce the required target proteins. This method has prooved to be more effective than therapeutic application of proteins prepared in advance, because their insertion into the organism lead to denaturation. The main task of this work was to prepare mRNA in vitro and mRNA transfection into the cells and monitoring the expression of target proteins with the method of Western blotting. The target proteins were from families of cyclins and cyclin-dependent kinases, which play an important role in cell cycle regulation. The mRNAs for 8 types of molecules have been prepared, including non-mutated forms of cyclins D1, D2, and D3, and cyclin-dependent kinase 6, as well were synthesized mutated versions of cyclins D1 T286AT288A, D2 T280A, D3 T283A and cyclin-dependent kinase 4 R24C. As for cyclins, there was a substitution of aminoacid threonine for alanine. This substitution could cause slowdown degradation of proteins in comparision with those existing in natural form. Regarding the cyclin- dependent kinase 4 the exchange of aminoacid arginine for cysteine causes its bigger stability in vivo. The prepared mRNA which encodes mentioned regulators of cell cycle was transfected into isolated...

Jedním z moderních léčebných postupů je aplikace in vitro transkribované mRNA do cílových buněk za účelem tvorby požadovaných proteinů. Zmíněná metoda se ukázala být daleko efektivnější než terapeutické podání již předem připravených proteinů, kde při jejich vpravení do organismu docházelo k denaturaci. Hlavní náplní této práce byla in vitro příprava mRNA, její následná trasfekce do buněk Langerhansových ostrůvků a detekce exprese cílových proteinů pomocí metody Western blot. Konktrétně se jednalo o proteiny z rodin cyklinů a cyklin dependentních kináz (CDK), které hrají významnou roli v regulaci buněčného cyklu. Celkem byla připravena mRNA pro 8 molekul, mezi které patřily nemutované formy cyklinů D1, D2 a D3 a cyklindependentní kináza 6, dále pak mutované verze cyklinů D1 T286AT288A, D2 T280A, D3 T283A a cyklin dependentní kináza 4 R24C. U cyklinů se jednalo o záměnu aminokyseliny threoninu za alanin. Tato záměna má za následek zpomalení degradace proteinu ve srovnání s přirozeně se vyskytující formou. Pro cyklin dependentní kinázu 4 záměna aminokyseliny argininu za cystein také spočívá ve zvýšení její stability in vivo. Připravená mRNA kódující uvedené regulátory buněčného cyklu byla transfekována do buněk Langerhansových ostrůvků izolovaných z potkaního pankreatu. Tato metoda by mohla v...