Vývoj alternativních proteolytických postupů pro identifikaci proteinu

Abstract

4 Abstrakt Metody výzkumu proteinů založené na hmotnostní spektrometrii přibývají v posledních letech na svém významu. Pro takzvaný bottom-up přístup je zásadní proteolytický krok, který určuje úspěšnost a relevanci identifikace a charakterizace proteinu, sekvenční pokrytí a ve vodík/deuteriové výměně spojené s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) prostorové rozlišení. Běžně používané proteázy mají ale své limitace. Z tohoto důvodu je snahou najít alternativy, které mají především jiné štěpné preference a aktivitní profil. AnPEP proteáza (prolyl endoproteáza z Aspergillus niger) je výhodná v tom, že je možné ji získat komerčně ve velkém množství a vyznačuje se štěpením za prolinem, v blízkosti kterého mnohé proteázy neštěpí. Tato práce se zabývá optimalizací štěpení AnPEP proteázou získanou z komerčního preparátu Gluten Rid with Tolerase G. Nejprve bylo provedeno štěpení AnPEP proteázou za různých podmínek na modelovém proteinu (bovinní karbonická anhydráza 2) a snahou bylo zjistit, jak se při změně podmínek (teploty, pH, koncentrace proteázy na nosiči nebo v roztoku) mění efektivita štěpení a štěpné preference této proteázy. Provedené experimenty ukázaly, že je AnPEP vhodný pro vodík/deuteriovou výměnu spojenou s hmotnostní spektrometrií v imobilizované formě i v roztoku. Naopak méně vhodný je z důvodu...

5 Abstract Methods of protein research based on mass spectrometry have become increasingly significant in the last few years. The proteolytic step is essential in a bottom-up approach, determining the success and relevance of identification and characterization of a protein and also the sequence coverage and spatial resolution of HDX-MS protocols. Conventionally used proteases however have their limitations and therefore efforts are being made to find alternatives that have, above all, different cleaving preferences and activity profiles. AnPEP protease (Aspergillus niger prolyl endoprotease) has the advantages of both characteristic cleavage in the presence of proline (unlike many other proteases) and easy accessibility due to its commercial obtainability in large quantities. This thesis examines the optimization of cleavage using AnPEP protease obtained from commercially prepared Gluten Rid with Tolerase G. Firstly AnPEP cleavage was tested on model protein (bovine carbonic anhydrase 2) under various conditions (temperature, pH, concentration of protease on a carrier or in solution). The objective was to find out how various conditions influence cleavage efficiency and preferences of this protease. It was discovered that AnPEP protease is suitable for hydrogen/deuterium exchange coupled to mass...