Preparation of strategy for studying interaction of human constitutive androstane receptor with steroid receptor coactivator-1

Abstract

Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakognozie Kandidát: Ivana Šachová Školitelé: PharmDr. Jan Martin, PhD., Dipl. Ing. Mgr. Ferdinand Molnár, PhD. Název diplomové práce: Příprava strategie pro studium interakcí mezi konstitutivním androstanovým receptorem (CAR) a koaktivátorem steroidního receptoru 1 Cílem této práce byla exprese wild type a mutovaných centrálních domén lidského SRC1 v buňkách E. coli BL21 DE3. Exprimované rekombinantní proteiny byly následně čištěny a použity pro studium SRC1-CAR interakcí za využití separace pomocí afinitních ligandů(pull down). Konstitutivní androstanový receptor (CAR), nukleární receptor, je transkripční regulátor, který ovlivňuje expresi nejrůznějších proteinů, jako jsou enzymy biotransformace a transportery významné pro metabolismus jak endogenních tak exogenních látek. CAR může být plně aktivní pouze v přítomnosti koaktivátorů jako je např. koaktivátor steroidního receptoru 1 (SRC1). Nejdůležitější fragment SRC1 pro vazbu na nukleární receptor je centrální doména, tvořená třemi α-helickými Leu-X-X-Leu-Leu (LXXLL) L1, L2, L3 motivy, v nichž L reprezentuje leucin a X znázorňuje jakoukoli aminokyselinu. hSRC1, stejně tak hCAR, mohou být produkovány pomocí exprese příslušných genů v kmenech E. coli. V případě SRC1, kodon...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacognosy Candidate: Ivana Šachová Supervisors: PharmDr. Jan Martin, PhD., Dipl. Ing. Mgr. Ferdinand Molnár, PhD. Title of diploma thesis: Preparation of strategy for studying interaction of human constitutive androstane receptor with steroid receptor coactivator-1 The aim of this study was to express wild type and mutated synthetic human SRC1 central domains in E. coli BL21 DE3 cells. Expressed recombinant proteins were purified afterwards and used for investigation of SRC1-CAR protein interaction using pull down experiments. The constitutive androstane receptor (CAR), a nuclear receptor (NR), is a transcriptional regulator, which influences the expression of various proteins, such as enzymes of biotransformation and transporters important for metabolism of both endogenous and exogenous compounds. CAR can be fully active only in presence of coactivators, such as steroid receptor coactivator-1 (SRC1). The most important fragment of SRC1 for binding to NRs is the central domain, made of three α-helical Leu-X-X-Leu-Leu (LXXLL) L1, L2, L3 motifs, in where L is a leucine and X represents any amino acid. hSRC1, as well as hCAR, can be successfully produced by expression of cDNA of interest in E. coli strains. In case of SRC1,...