Analysis of circulating markers in patients with solid tumors

Abstract

Cirkulujúca cell-free DNA (cfDNA) a jej frakcia, cirkulujúca tumorová DNA, pochádzajúca z nádoru, sú považované za inovatívny prognostický a prediktívny biomarker vo svete onkologickej diagnostiky. Mnohé štúdie preukázali pozmenené hladiny koncentrácie cfDNA a integrity - indikátora množstva ctDNA v rámci cfDNA, v telových tekutinách u pacientov s nádorovými ochoreniami v porovnaní so zdravými jedincami, čo poukazuje na ich potenciál ako efektívneho biomarkeru na monitorovanie dynamiky týchto ochorení. Táto práca sa sústredí na optimalizáciu a validáciu kvantifikačných metód, ktoré sú následne použité na analýzu spomínaných parametrov cfDNA u vzoriek štyroch rôznych nádorov. Najskôr boli otestované dva rôzne komerčné kity na izoláciu cfDNA u vzoriek plazmy a séra. Metódy na kvantifikáciu, kvantitatívna real-time polymerázová reakcia (qPCR) a PicoGreen dsDNA assay, boli optimalizované na efektívne kvantifikovanie nízkych koncentrácií cfDNA, a následne porovnané medzi sebou a ku droplet digital PCR, ktorá bola použitá na vybraný počet vzoriek. Zároveň bola stanová koncentrácia a integrita cfDNA vzoriek karcinómu prsu, vaječníkov, kolorekta a pankreasu. Väčší výťažok cfDNA bol získaný pomocou kitu QIAamp Circulating Nucleic Acid isolation kit (Qiagen) v porovnaní s kitom Plasma/Serum Cell-Free...

Circulating cell-free DNA (cfDNA) and its tumour-derived circulating tumour DNA (ctDNA) fraction are considered an innovative prognostic and predictive biomarker in oncological diagnostics. Many studies have demonstrated higher levels of cfDNA concentration and integrity, as an indicator of the amount of ctDNA in cfDNA, in body fluids from patients with cancer diseases in comparison with healthy individuals, which suggest its potential as an effective biomarker for monitoring of the tumour dynamics. This study focused on optimisation and validation of measurement methods later used for analysis of cfDNA concentration and integrity in blood samples from patients with four different solid cancers. Two different commercial isolation kits have been tested in plasma and serum samples. Quantitative real-time polymerase reaction (qPCR) and PicoGreen dsDNA assay were optimized to effectively quantify low concentrations of cfDNA, subsequently compared to each other and to droplet digital PCR assay tested on selected samples. The concentration and integrity of cfDNA from plasma samples of breast, ovarian, colorectal and pancreatic cancer patients were evaluated. Higher amounts of cfDNA were obtained by the QIAamp Circulating Nucleic Acid isolation kit (Qiagen) in comparison to Plasma/Serum Cell-Free...