Analýza postranslačních modifikací proteinů hmotnostní spektrometrií

Abstract

Viry, původci mnoha infekčních onemocnění, jsou malé nebuněčné částice replikující se pouze v hostitelských buňkách. Předpokládá se, že za jejich infektivitu jsou zodpovědné posttranslační modifikace virových kapsidových proteinů (např. fosforylace, které jsou katalysovány kinasami hostitelských buněk). Vhodným modelem, který lze využít pro studium vztahu fosforylačního "profilu" viru a infektivity je myší polyomavirus z čeledi Polyomaviridae. Srovnáním virionů, a tedy i hlavních kapsidových proteinů VP1 divokého kmene myšího polyomaviru s virovou mutantou vytvořenou pomocí delece části genomu kódujícího regulační proteiny viru a produkovaných ve dvou různých buněčných liniích WOP a 3T6, byla zjištěna hmotnostní spektrometrií majoritní fosforylace na třech konkrétních aminokyselinách VP1. Ty jsou považovány za důležité pro správnou morfogenesi virionů a jejich schopnost infikovat hostitelské buňky. Kvalitativní zastoupení nebylo ovlivněno volbou buněčné linie. Kromě toho, v případě pozorování "dimerizace" VP1 na elektroforeogramu SDS-PAGE byla v aminokyselinové sekvenci detekována dvojitá fosforylace VP1: pThr63, pSer66 v našem experimentálním provedení in vivo. Je tedy pravděpodobné, že posttranslační modifikace, konkrétně fosforylace mohou ovlivňovat strukturní vlastnosti virových proteinů....

Viruses, etiological agents of many infectious diseases, are small noncellular particles that run their replication process solely inside host cells. It is generally assumed that the posttranslational modifications of viral capsid proteins are responsible for their infectivity (e.g. phosphorylation catalysed by kinases of host cells). The appropriate model for study of the viral phosphorylation "profile" relation with its infectivity is mouse polyomavirus of the Polyomaviridae family. By comparison of virions, as well as the major capsid protein VP1 of wild type mouse polyomavirus with viral mutant created by deletion of the part of the genome coding regulatory proteins of virus and produced in two different cell lines WOP and 3T6 was found by mass spectrometry a major phosphorylation in the three specific amino acids of VP1. These are considered important for proper morphogenesis of virions and their ability to infect host cells. The qualitative representation was not affected by the cell line selection. Furthermore, in case of VP1 "dimerization" detected on SDS-PAGE electrophoretogram the double phosphorylation of VP1 pThr63, pSer66 was confirmed in our experimental in vivo approach. Therefore, posttranslational modifications, specifically phosphorylation, could probably affect structural...