Charakterizace unikátních proteinů Giardia intestinalis a jejich úloha v biogenezi mitosomů.

Abstract

Jednobuněčný parazit Giardia intestinalis je jedním z organismů nesoucích mitochondriím příbuznou organelu označovanou jako mitosom, přizpůsobenou mikroaerobnímu stylu života. Jedinou doposud známou funkcí mitosomů tohoto prvoka je syntéza železosirných center. Studium mitosomálního proteomu vede k získávání informací o biogenezi a funkci této neobvyklé organely. K rozšiřování znalostí o mitosomech jsou v posledních letech hojně využívány analýzy interaktomů známých mitosomálních proteinů. Moderní metodou je využití chemického crosslinku a následné imunoafinitní izolace komplexů obsahujících studovaný protein. V této práci byly bioinformatickými nástroji blíže charakterizovány proteiny potenciálních interaktomů proteinů GiTom40 a GiMOMP35. U čtyř vybraných proteinů byla pomocí fluorescenční mikroskopie určena buněčná lokalizace. Vybraný protein predikovaný jako střední řetězec dyneinu DIC6939 byl fylogeneticky zařazen mezi axonemální dyneiny. Superrezoluční mikroskopií byla zkoumána jeho kolokalizace s mitosomy a pomocí modré nativní elektroforézy byly vizualizovány nativní komplexy obsahující DIC6939. V rámci této práce se podařila také optimalizace podmínek nutných pro izolaci interaktomu DIC6939. Výsledkem této práce je první experimentální charakterizace středního řetězce dyneinu v G. intestinalis.

The unicellular parasite Giardia intestinalis is one of the organisms carrying mitochondrion-related organelle known as mitosome, which is adapted to the microaerobic lifestyle. The only known fuction of the mitosome is the synthesis of the iron-sulphur clusters. The research of the mitosomal proteome provides new information on the biogenesis and function of this unusual organelle. One of the means of the mitosome research is the analysis of the interactome of the known mitosomal proteins. The state-of- the-art method of the interactome approach is the use of the chemical crosslinking and the subsequent immunoaffinity isolation of the complexes, containing the protein of interest. In this thesis, the interactomes of GiTom40 and GiMOMP35 were characterized with the bioinformatic tools. The cellular localization of four of the chosen proteins was determined by the fluorescent microscopy. One of the proteins, the predicted dynein intermediate chain DIC6939, was phylogenetically classified as an axonemal dynein. The superresolution microsopy was utilized to observe the possible colocalization of DIC6939 with the mitosomes and blue native PAGE led to the visualization of its native complexes. In this work, the optimal conditions for DIC6939 interactome isolation were succesfully determined. The outcome...