Příprava mutantních forem cytochromu b5 s fotoreaktivními aminokyselinami a jejich síťování s vazebnými partnery
Preparation of cytochrome b5 mutants containing photoreactive amino acids, and their crosslinking with the interaction partners
bakalářská práce (OBHÁJENO)

Zobrazit/ otevřít
Trvalý odkaz
http://hdl.handle.net/20.500.11956/102235Identifikátory
SIS: 196771
Kolekce
- Kvalifikační práce [20202]
Autor
Vedoucí práce
Konzultant práce
Šulc, Miroslav
Oponent práce
Kukačka, Zdeněk
Fakulta / součást
Přírodovědecká fakulta
Obor
Biochemie
Katedra / ústav / klinika
Katedra biochemie
Datum obhajoby
3. 9. 2018
Nakladatel
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaJazyk
Čeština
Známka
Velmi dobře
Klíčová slova (česky)
cytochrom b5, fototreaktivní aminokyseliny, síťování proteinůKlíčová slova (anglicky)
cytochrome b5, photoreactive amino acids, protein crosslinkingCytochrom b5 plní funkci přenašeče elektronů v klinicky významném systému oxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému). Tento systém se podílí na zvýšení hydrofility látek v první fázi biotransformace xenobiotik a na aktivaci nebo deaktivaci některých léčiv a karcinogenů. Cytochrom b5 ovlivňuje reakce katalyzované terminálními oxygenasami systému - cytochromy P450. Donory elektronů cytochromu b5 jsou NADH:cytochrom b5 reduktasa a NADPH:cytochrom P450 reduktasa Cílem této práce bylo ověřit, zda je možné pomocí metody foto-chemického zesítění fixovat transientní interakce mezi těmito proteiny. Takto získané kovalentní komplexy mohou být dále analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie a poskytují strukturní informace o vazebných místech proteinů. Pro účely foto-síťování byl připraven mutantní cytochrom b5 obsahující v sekvenci v pozici 41 foto-aktivovatelný analog methioninu. Protein jsme exprimovali ve 300 ml limitního média, ve kterém byl methionin nahrazen L-2-amino-5,5-azi-hexanovou kyselinou (foto-methionin), a použili k tomu auxotrofní kmen bakterií E. coli B834(DE3). Míra inkorporace nepřirozené aminokyseliny byla po 16 h exprese stanovena pomocí hmotnostní spektrometrie na přibližně 40 %. Izolací jsme získali celkem 15,4 nmol mutantního cytochromu b5 o koncentraci 76,8 µmol/l. Získaný...
Cytochrome b5 is an electron transport protein of a clinically prominent mixed-function oxygenase (MFO) system. This system participates in the first stage of xenobiotic biotransformation. The hydrofility of xenobiotics is increased by introduction of an oxygen atom into their structure. The MFO system also activates or deactivates certain drugs and carcinogens. Cytochrome b5 affects reactions catalyzed by the terminal oxygenases of the system - cytochromes P450. Electrons are donated to cytochrome b5 by redox partners NADH:cytochrome b5 reductase and NADPH:cytochrome P450 reductase. The aim of this work was to demonstrate capability of photo-crosslinking approach to fixate transient interactions within MFO system. Covalent complexes obtained by this technique could be further analyzed by mass spectrometry, which can provide structural information about the binding sites of the proteins. We prepared a mutant cytochrome b5 comprising photo-reactive methionine analogue in the position 41 of the sequence. We expressed the protein employing E. coli B834 (DE3) auxotrophic strain in 300 ml of the limit medium supplemented with L-2- amino-5,5-azi-hexanoic acid (photo-methionine). The rate of the unnatural amino acid incorporation was determined by mass spectrometry and it was about 40 % after 16 hours of...