UNIVERZITA KARLOVA Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Studijní program: Biochemie Studijní obor: Biochemie Tomáš Smrčka Porovnání různých molekulárně-biologických přístupů pro detekci přítomnosti DNA patogenní bakterie Haemophilus influenzae Comparison of different molecular-biological approaches for detecting the presence of DNA of the pathogenic bacterium Haemophilus influenzae BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Školitel: doc. RNDr. Markéta Martínková, Ph.D. Konzultant: Mgr. Petr Jeřábek, Ph.D. Praha 2021 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl/a všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne 16.6.2021 ……………………… 2 Poděkování: Na tomto místě bych rád poděkoval školitelce doc. RNDr. Markétě Martínkové, Ph.D. za odbornou pomoc a trpělivost při zpracování předkládané závěrečné práce. Mé díky také patří Mgr. Petru Jeřábkovi, Ph.D. za jeho trpělivé rady při provádění jednotlivých experimentů. Vypracování této bakalářské práce bylo podpořeno a umožněno grantem 8F20011 MŠMT v rámci mezinárodního konsorcia studujícího prevenci antibiotikové rezistence zaměřením na správnou léčbu pneumonií u dětí, konkrétně „Prevention of antibiotic resistance by TARGEted Treatment of pneumonia in children (TARGET)“. 3 Abstrakt Haemophilus influenzae patří mezi hlavní původce meningitidy a zápalu plic u dětí. Zavedení rychlé, levné a přístrojově nenáročné metody detekce tohoto patogenu by zásadní měrou přispělo k včasné a cílené léčbě pacientů. Rozvoj amplifikačních metod v posledních dekádách umožňuje, krom běžně používané metody PCR, aplikaci alternativních přístupů, mezi něž patří i metoda LAMP. Předmětem zájmu této bakalářské práce proto bylo studium alternativní metody LAMP jakožto nástroje pro detekci Haemophilus influenzae. LAMP metoda byla pro Haemophilus influenzae úspěšně zavedena, nicméně se potýkala s falešnou pozitivitou negativní kontroly v případě delších inkubačních časů. Byla proto navržena optimalizovaná metoda LAMP v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu a uracil-DNA glykosylasy. Jejím cílem bylo za pomocí inkorporace uracilů do amplifikovaných úseků DNA a následného odštěpení uracilů působením uracil-DNA glykosylasy pozměnit strukturu amplifikačních produktů, zabránit tak jejich replikaci při případné kontaminaci reakčních směsí při dalších stanoveních a tím snížit riziko falešné pozitivity negativních kontrol na minimum. Byla optimalizována koncentrace deoxyuridintrifosfátu v reakční směsi pro výše uvedené účely. Zásadním přispěním předkládané bakalářské práce k optimalizaci LAMP metody pro detekci Haemophilus influenzae bylo zjištění, že působením uracil-DNA glykosylasy skutečně dochází ke změně struktury amplifikované DNA metodou LAMP v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu. Bylo stanoveno přibližné diagnostické okno metody LAMP bez deoxyuridintrifosfátu i optimalizovaného LAMP v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu. Klíčová slova: Haemophilus influenzae, polymerázová řetězová reakce (PCR), izotermální amplifikace DNA pomocí smyček (LAMP) 4 Abstract Haemophilus influenzae is one of the main initiators of meningitis and pneumonia in children. Implementation of fast, cheap and instrumentally accessible method for detection of this pathogen would enable an early and targeted treatment of patients. The development of amplification methods in the last decades enables, apart from commonly used PCR method, application of alternative approaches, such as the LAMP. The focus of this Bachelor thesis was the study (research) of the alternative method LAMP as a tool for detection of Haemophilus influenzae. The LAMP method was successfully implemented for Haemophilus influenzae, however, it has contended with the false positive results of negative control in case of longer incubation times. Therefore, the optimized LAMP method was designed in presence of deoxyuridine triphosphate and uracil-DNA glycosylase. Its aim was to change the structure of LAMP products via the incorporation of uracils to amplified regions of DNA and subsequent removal of uracils with influence of uracil-DNA glycosylase, and therefore prevent their replication during potential contamination of reaction mixtures and consequently reduce the risk of false positive results of negative controls to minimum. The concentration of deoxyuridine triphosphate in reaction mixtures was optimized for the purposes mentioned above. The fundamental contribution of the present thesis of optimized LAMP method for detection of Haemophilus influenzae was the finding that the uracil-DNA glycosylase effects the structure of the amplified DNA by the LAMP method in presence of deoxyuridine triphosphate. The approximate diagnostic window of the LAMP method without deoxyuridine triphosphate and of the optimized LAMP in presence of deoxyuridine triphosphate was determined. Key words: Haemophilus influenzae, polymerase chain reaction (PCR), isothermal loop mediated DNA amplification (LAMP) 5 Obsah SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK .................................................................................... 7 1 ÚVOD ............................................................................................................................. 9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED .............................................................................................. 10 2.1 IZOTERMÁLNÍ AMPLIFIKACE DNA POMOCÍ SMYČEK ........................................................................ 10 2.1.1 Princip metody ............................................................................................................................ 10 2.1.2 Principy detekce produktů LAMP reakce .................................................................................... 14 2.1.3 Bst DNA polymerasa ................................................................................................................... 17 2.1.4 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček pro detekci Haemophilus influenzae................... 17 2.2 DALŠÍ METODY AMPLIFIKACE DNA ................................................................................................. 20 2.2.1 Polymerázová řetězová reakce .................................................................................................... 20 2.2.2 Amplifikace DNA pomocí nahrazení vlákna nukleové kyseliny ................................................... 21 2.3 KONTAMINACE AMPLIFIKAČNÍCH REAKCÍ ........................................................................................ 22 2.3.1 Vliv Ultrafialového záření na degradaci DNA ............................................................................ 23 2.3.2 Uracil-DNA glykosylasa ............................................................................................................. 24 2.3.2.1 Mechanismus ..................................................................................................................................... 25 2.3.2.2 Užití Uracil-DNA glykosylasy při amplifikačních reakcích .............................................................. 26 3 CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE .................................................................................... 28 4 MATERIÁL A METODY ............................................................................................ 29 4.1 POUŽITÉ PŘÍSTROJE .......................................................................................................................... 29 4.2 POUŽITÝ MATERIÁL A CHEMIKÁLIE .................................................................................................. 29 4.3 METODY ........................................................................................................................................... 31 4.3.1 Horizontální agarosová elektroforéza ......................................................................................... 31 4.3.2 Polymerázovářetězová reakce ..................................................................................................... 32 4.3.3 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček ............................................................................. 33 4.3.4 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu .............. 35 4.3.5 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu a Uracil-DNA glykosylasy ............................................................................................................................................... 36 5 VÝSLEDKY ................................................................................................................. 38 5.1 POLYMERÁZOVÁŘETĚZOVÁ REAKCE PRO HAEMOPHILUS INFLUENZAE .............................................. 38 5.2 IZOTERMÁLNÍ AMPLIFIKACE DNA POMOCÍ SMYČEK PRO HAEMOPHILUS INFLUENZAE ...................... 41 5.3 IZOTERMÁLNÍ AMPLIFIKACE DNA POMOCÍ SMYČEK PRO HAEMOPHILUS INFLUENZAE V PŘÍTOMNOSTI DEOXYURIDINTRIFOSFÁTU ............................................................................................................................. 44 5.4 IZOTERMÁLNÍ AMPLIFIKACE DNA POMOCÍ SMYČEK PRO HAEMOPHILUS INFLUENZAE S PŘIDÁNÍM DEOXYURIDINTRIFOSFÁTU A URACIL-DNA GLYKOSYLASY ........................................................................... 48 6 DISKUSE ...................................................................................................................... 51 7 ZÁVĚR ......................................................................................................................... 57 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ ..................................................................................... 58 6 Seznam použitých zkratek B1 sekvence templátového DNA, komplementární s B1c „primeru“ BIP B1c sekvence „primeru“ BIP, vazbou na B1 vytváří smyčku B2 sekvence „primeru“ BIP, vazba na B2c B2c sekvence templátové DNA, komplementární s B2 „primeru“ BIP B3 zadní vnější „primer“, backward outer primer BIP zadní vnitřní „primer“, z anglického backward inner primer Bst Bacillus stearothermophilus DNA deoxyribonukleová kyselina, z anglického deoxyribonucleic acid dTMP deoxythimidin monofosát dTTP deoxythimidin trifosát dUMP deoxyuridin monofosfát dUTP deoxyuridin trifosfát F1 sekvence templátového DNA, komplementární s F1c „primeru“ FIP F1c sekvence „primeru“ FIP, vazbou s F1 vytváří smyčku F2 sekvence „primeru“ FIP, vazba s F2c F2c sekvence templátové DNA, komplementární s F2 „primeru“ FIP F3 přední vnější „primer“, z anglického forward outer primer 7 FIP přední vnitřní „primer“, z anglického forward inner primer glpQ gen kódující glycerofosfodiester fosfodiesterasu HI Haemophilus influenzae IAC vnitřní amplifikační kontrola, z anglického internal amplification control LAMP izotermální amplifikace DNA pomocí smyček, z anlického loop-medieted isothermal amplification PCR polymerázová řetězová reakce, z anglického polymerase chain reaction SDA amplifikace DNA pomocí nahrazení vlákna nukleové kyseliny, z anglického strand displacement amplification Taq Thermus aquaticus Tth Thermus thermophilus UDG uracil-DNA glykosylasa UV ultrafialové, z anglického ultraviolet 8 1 Úvod Amplifikační metody umožňují během krátké doby vytvořit ohromné množství specifických sekvencí deoxyribonukleové kyseliny (DNA, z anglického deoxyribonucleic acid) a následně je efektivně detekovat. Díky této své vlastnosti sehrávají nepostradatelnou roli při detekci celé řady patogenů. Krom běžně používané polymerázové řetězové reakce (PCR, z anglického polymerase chain reaction), dochází v posledních dekádách k rozvoji a aplikaci další amplifikační metody – izotermální amplifikace DNA pomocí smyček (LAMP, z anglického loop-medieted isothermal amplification) [1]. Tato jednoduchá a přístrojově nenáročná metoda se zdá být pro svůj potenciál následného uvedení do klinické praxe zajímavým předmětem výzkumů. Vzhledem k její vysoké efektivitě se ovšem metoda LAMP často potýká s falešnou pozitivitou negativních kontrol vyvolanou kontaminací produkty předchozích amplifikací [2]. Hlavním cílem této bakalářské práce bylo aplikovat metodu LAMP pro detekci Haemophilus influenzae (HI) zacílenou na gen kódující glycerofosfodiester fosfodiesterasu (glpQ) a prostudovat možnosti eliminace kontaminace reakčních směsí produkty předchozích reakcí. Takto koncipovaná metoda by v budoucnu mohlo být potenciálním nástrojem detekce HI v klinické praxi. 9 2 Literární přehled 2.1 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček Metoda LAMP je jednou z nejrychleji se rozvíjejících amplifikačních metod. Poprvé byla popsána v roce 2000 Tsugunorim Notomim a kolektivem [3]. V porovnání s jinými amplifikačními metodami je vysoce specifická, nenáročná na instrumentaci a rychlá [1,4,5]. LAMP využívá účinného amplifikačního mechanismu (více kapitola 2.2.1), který ovšem souvisí i s jedním z hlavních nedostatků této metody. Vytvoření velkého množství amplikonů v krátkém čase s sebou nese značné riziko v podobě falešné pozitivity způsobené kontaminací DNA produkty předchozích amplifikací [1,2]. 2.1.1 Princip metody Metoda LAMP využívá čtyři až šest „primerů“, tj. krátkých úseků oligonukleotidů o specifické sekvenci. Varianta metody se čtyřmi „primery“ pracuje se dvěma vnitřními a dvěma vnějšími „primery“ [1,3,4]. Vnitřními jsou přední vnitřní „primer“ (FIP, z anglického forward inner primer) a zadní vnitřní „primer“ (BIP, z anglického backward inner primer). Oba tyto „primery“ obsahují dvě rozdílné oligonukleotidové sekvence. První sekvencí je F2 (popřípadě B2), která v počátečním kroku amplifikace vytvoří vazbu s komplementárním F2c (popřípadě B2c). Druhou sekvencí je pak F1c (popřípadě B1c), která se v následujících krocích amplifikace váže na sekvenci F1 (popřípadě B1) a vytváří smyčku (z anglického loop). Vnějšími „primery“ jsou F3 (přední vnější „primer“, z anglického forward outer primer) a B3 (zadní vnější „primer“, backward outer primer). Jejich funkcí je pomocí elongace vláken odštěpení vláken s FIP a BIP „primery“. Sledy reakcí lze v LAMP metodě rozdělit do tří fází – počáteční fáze, cyklická amplifikační fáze a elongační a recyklační fáze [3]. Na rozdíl od jiných amplifikačních metod není v LAMP metodě nutné DNA tepelně denaturovat, produktu reakce s pre-denatruačním krokem a bez něj bývá dosaženo obdobně rychle [6,7]. V počáteční fázi dochází nejprve k nasednutí „primeru“ BIP na templátové DNA, konkrétně sekvence B2 na sekvenci B2c, a elongaci vlákna (viz Obrázek 1, strana 12) [1,3,4,7]. Následně se na stejnou templátovou DNA váže „primer“ B3, Bacillus 10 stearothermophilus DNA polymerasa (Bst DNA polymeresa) spouští elongaci a dochází k odštěpení původně navázaného vlákna s BIP „primerem“. Vlákno s BIP „primerem“ vytvoří na svém 5´ konci smyčku (vazba B1 na B1c) a na jeho 3´ konci se naváže FIP „primer“ (vazba F2 na F2c). Vlákno s FIP „primerem“ se elonguje a „rozmotává“ smyčku – vazba B1 na B1c „primeru“ BIP je přerušena a je nahrazena vazbou B1 na B1c nově elongovaného vlákna. Poté se naváže F3 „primer“ a obdobně jako v případě B3 „primeru“ dochází k elongaci a následnému odštěpení předchozího vlákna. Toto vlákno již obsahuje sekvence FIP i BIP a vytvoří na obou koncích smyčky. Taková struktura se označuje jako „struktura připomínající činku“ (z anglického dumbbell-like structure). V cyklické amplifikační fázi dochází nejprve k elongaci vlákna s počátkem v B1 „primeru“ a tím i k „rozmotání“ smyčky na 5´ konci. Následně dochází k dosednutí BIP „primeru“ do oblasti smyčky. V elongační a recyklační fázi dochází k elongaci vlákna s tímto BIP „primerem“, částečnému odštěpení původního vlákna a vytvoření nové smyčky na tomto vlákně. Tím vzniká struktura obsahující dvě smyčky a jedno raménko (z anglického stem-loop structure). Následně postupně nasedají FIP potažmo BIP „primery“ do oblastí smyček. Vznikají struktury s většími počty smyček a ramének. Výše popsaný mechanismus je jenom jeden z možných scénářů, které nastávají s vyšší či nižší pravděpodobností během procesu – např. v prvním kroku počáteční fáze může dosednout FIP a ne BIP „primer“; to stejné platí pro první krok cyklické amplifikační fáze. Varianta metody se šesti „primery“ je založena na stejných principech a až do elongační a recyklační fáze probíhá stejným mechanismem jako metoda se čtyřmi „primery“. K sadě čtyř „primerů“ jsou přidány ještě dva smyčkové „primery“ B a F (z anglického loop-B a loop-F) [7]. Jedná se o sekvence DNA mezi F1 a F2 (popřípadě B1 a B2) sekvencemi ve směru z F1 na F2 (popřípadě z B1 na B2). Smyčkové „primery“ obdobně jako vnitřní „primery“ dosedají na smyčky vytvořené v elongační a recyklační fázi, dochází k elongaci vláken s těmito „primery“ a vzniku nových struktur (viz Obrázek 2, strana 13). U detekce 11 některých patogenů, například viru hepatitidy B, smyčkové „primery“ prokazatelně snižují dobu reakce na méně než polovinu původního času [7]. Obrázek 1: Základní mechanismus LAMP sestávající se ze tří kroků – počáteční fáze (tvorba výchozí látky), cyklická amplifikace a elongace a recyklace. V prvním kroku dochází k postupnému dosedání BIP, B3, FIP a F3 „primerů“ a následné elongaci vláken s těmito „primery“, přičemž elongace vláken s F3 nebo B3 „primery“ vede k odštěpení vláken předchozích. Hybridizací B1 s B1c (popřípadě F1 s F1c) se vytvářejí smyčky a vzniká struktura 6. Ta vstupuje do kroku cyklické amplifikace, ve kterém nasedá BIP nebo FIP „primer“ do oblasti smyčky a následnou elongací vzniká struktura 10. Opětovným nasedáním FIP a BIP „primerů“ do oblasti smyček vznikají další struktury. Šrafované šipky reprezentují následné reakce. Převzato a upraveno z [7]. 12 Obrázek 2: Varianta LAMP využívající šesti „primerů“. Do oblasti smyček dosedají „primer“ FIP a smyčkový „primer“ B. Černé šipky reprezentují reakce základního mechanismu LAMP se čtyřmi „primery“ (viz Obrázek 1, strana 12). Červené šipky reprezentují reakce indukované smyčkovými „primery“. Šrafované červené šipky reprezentují následné reakce. Převzato a upraveno z [7] 13 Pro detekci ribonukleové kyseliny virů lze užít reverzně transkripční LAMP (RT- LAMP). Bst DNA polymerasa je do reakční směsi přidávána společně s reverzní transkriptasou a oba enzymy jsou inkubovány při stejné teplotě, což celou metodu činí jednoduchou a rychlou [1,3,4]. K současné amplifikaci rozdílných DNA několika druhů patogenů nebo jednotlivých sérotypů jednoho patogenu lze užít tzv. multiplexového LAMP. Pro detekci patogenu existujícího v různých sérotypech byl zaznamenán úspěch například při detekci horečky dengue [1,8]. Tento patogen se přirozeně nachází ve čtyřech různých sérotypech (DENV 1- 4). Pro každý sérotyp zvlášť bylo navrženo 6 „primerů“, dohromady tedy 24 „primerů“. Všechny „primery“ byly najednou přidány do jednoho společného roztoku. Tímto přístupem využívajícím všech 24 „primerů“ najednou bylo dosaženo specifické amplifikace a následně spolehlivé detekce horečky dengue pro všechny sérotypy [8]. Pro detekci dvou různých patogenů byl zaznamenán úspěch například při detekci běžných bakterií kontaminujících potravu – Salmonella spp. a Vibrio parahaemolyticus [9]. Nejprve (obdobně jako u detekce chřipky dengue) byly připraveny 2 rozdílné sety „primerů“, jeden pro Salmonella spp a druhý pro Vibrio parahaemolyticus. Následně byly oba sety společně s reakčním mixem najednou přidány do jediné zkumavky a byla spuštěna amplifikace. Produkty amplifikace obou bakterií bylo následně možné rozdělit vzhledem k jejich rozdílné teplotě tání pomocí fluorescenční analýzy bodu tání (jinými slovy byla v prvním kroku prokázána přítomnost alespoň jedné z bakterií a v kroku druhém bylo možné prokázat, o kterou bakterii se konkrétně jedná) [9]. 2.1.2 Principy detekce produktů LAMP reakce Detekce produktů LAMP reakce je proveditelná mnoha způsoby [1,10]. Z fyzikálně chemického hlediska lze tyto způsoby rozdělit do čtyř hlavních skupin – detekce na bázi turbidimetrie, pH indikace, gelové elektroforézy a aktivace nebo inhibice fluorescence přidané molekuly po interakci s vedlejšími nebo přímými produkty LAMP. 14 Turbidimetrie využívá vzniku bílého zákalu pyrofosfátu hořečnatého jakožto vedlejšího produktu LAMP [1,4,11,12]. Vznik pyrofosfátu a jeho hořečnaté soli je popsán v následujících rovnicích [13]. (DNA)n-1 + dNTP (DNA)n + P 4- 2O7 (1.1) P2O 4- 7 + 2Mg2+ Mg2P2O7. (1.2) Je zřejmé, že nárůst látkové množství pyrofosfátu hořečnatého v roztoku je přímo úměrný počtu navázaných nukleotidů a koreluje s nárůstem množství nově amplifikovaného DNA. Závislost mezi turbiditou a koncentrací DNA byla shledána jako lineární [12]. Nicméně jedná se pouze o nepřímou metodu stanovení, která neanalyzuje specifitu vzniklých DNA amplifikačních produktů. Vznik pyrofosfátu hořečnatého může být v určité míře vyvolán i tvorbou dimerů „primerů“ (struktury vznikající vzájemnou hybridizací dvou „primerů“) či nespecifickou amplifikací, což může vézt k falešné pozitivitě vzorků [10]. Při elongaci DNA vlákna dochází k uvolnění kationtu vodíku z hydroxylové skupiny deoxyribosy do roztoku, a tím i k snížení pH (viz Obrázek 3). Tohoto faktu je užito při detekci produktů pomocí pH indikace. H N nukleotidový řetězec 2 N OH HN O nukleotidový řetězec H2N – N O P O + O H N N OH HN O O HO P O O N N H O O H2N H2N N N O HN O – – – – – O O O HN O O O – – – – O P O O P O P O P O O P O P O O O N N N N O O O O O O HO HO Obrázek 3: Prodloužení nukleotidového řetězce o jeden nukleotid. Kyslík z hydroxylové skupiny 2´-deoxyguanosin-5´-monofosfátu se váže na fosfor z 2´-deoxyguanosin-5´-trifosfátu. Dochází k odštěpení pyrofosfátu a kationtu vodíku. Používaným pH indikátorem je například fenolová či kresolová červeň (při snížení pH dochází ke změně červené barvy na žlutou) [14]. Nenáročná instrumentace a jednoduchá 15 vizualizace výsledků je stěžejním kladem této metody. Jak je ovšem patrné z mechanismu indikace, hlavním nedostatkem, na který je třeba brát zřetel při návrhu „primerů“, je nespecifičnost detekce – obdobně jako u turbidimetrie nemůžeme vyloučit vznik dimerů jednotlivých „primerů“ či nespecifickou amplifikaci, které by vedly k falešné pozitivitě. Kromě pH indikace lze docílit jednoduché detekce pomocí změny barvy viditelné pouhým okem i u fluorescenčních barviv. Mezi užívaná fluorescenční barviva v LAMP metodě patří například kalcein či SYBR green [1]. Kalcein vstupující do reakce má ve svém základním stavu navázaný manganatý ion, který zabraňuje fluorescenci [15]. Pokud ovšem dojde k LAMP reakci, vzniklý pyrofosfát vyváže manganatý ion z kalceinu za vzniku nerozpustného pyrofosfátu manganatého a tím je spuštěna fluorescence kalceinu. Ta je navíc ještě zesílena vazbou hořečnatého iontu s kalceinem. Fluorescence je pozorovatelná pod ultrafialovém zářením, ale i ve viditelné oblasti změnou barvy z oranžové na zelenou. Při detekci Clostridium difficile bylo užito turbidimetrické detekce a detekce využívající kalcein – výsledky se v obou případech shodovali [11]. Dalším možným fluorescenčím činidlem je SYBR green [1,13]. Po vazbě SYBR green na dvouvláknou DNA je spuštěna fluorescence viditelná pouhým okem – změna barvy z oranžové na zelenou. Hlavní nevýhodou u obou zmíněných barviv je, obdobně jako u turbidimetrie či pH indikace, nespecifičnost detekce – ani jedno ze zmíněných činidel nedetekuje přítomnost specifické sekvence DNA [16]. Pro detekci specifické sekvence námi hledaného úseku DNA se využívá fluorescenční sondy. V případě LAMP se konkrétně využívá tzv. „zhášecí sonda“ (z anglického quenching probe) – sonda ve svém základním stavu fluoreskuje a až po navázání na specifickou sekvenci je její fluorescence inhibována [10]. Zhášecí sonda obsahuje sekvenci smyčkového „primeru“ prodlouženou o několik nukleotidů na svém 3´ konci, čímž je zaručena specifická vazba sondy na hledaný úsek DNA. Na 3´ konci má přes cytosin navázaný fluereskující boron-dipyrromethen. Svou lokací boron-dipyrromethen zabraňuje následné elongaci zhášecí sondy. Po hybridizaci cytosinu s guaninem je fluorescence inhibována. Úspěšné užití detekce na bázi zhášecí sondy v LAMP metodě bylo pozorováno například při detekci Blízkovýchodního respiračního syndromu (MERS-CoV) [17]. 16 Detekci na bázi fluorescence využívá i gelová elektroforéza [1,10]. Podle různé rychlosti pohybu DNA fragmentů (produktů amplifikace) v agarosovém gelu se tyto fragmenty rozdělují dle velikosti. Vizualizace je umožněna pomocí ethidium bromidu obsaženého v gelu. Ten se interkaluje do dvouvlákné DNA a touto vazbou je znásobená jeho fluorescence [18]. Díky vzniku velkého množství rozdílných struktur o rozdílných velikostech se produkty LAMP v agarosovém gelu seřazují „žebříkovitě“. Podstatnou nevýhodou gelové elektroforézy je nutnost opětovného otvírání zkumavek po LAMP reakci, kdy už se v pozitivních vzorcích vyskytuje značné množství amplifikované DNA, které pak pro další stanovení představuje podstatné riziko kontaminace. Ke gelové elektroforéze je navíc zapotřebí příslušných přístrojů (elektrodová vanička a zdroj napětí) a vysoce toxického a karcinogenního ethidium bromidu. To činí celou metodu relativně náročnou na instrumentaci. Časová náročnost je navíc u gelové elektroforézy podstatně větší než u předchozích metod a LAMP reakci nelze sledovat v reálném čase. 2.1.3 Bst DNA polymerasa Bacillus stearothermophilus DNA polymeresa je enzym s vysokou vlákno-nahrazující aktivitou; katalysuje zároveň rozpojování dvouvláknové DNA a syntézu nového nahrazujícího vlákna [19]. Z tohoto důvodu je Bst DNA polymerasa vhodným enzymem pro LAMP metodu, při níž opakovaně dochází k syntéze nového vlákna DNA za současného uvolnění vlákna předchozího. Bst DNA polymerasa nejeví takovou termostabilitu jako Thermus aquaticus DNA polymerasa (Taq DNA polymerasa) – ztrácí svou katalytickou aktivitu již při 70 °C, což je také důvodem, proč u LAMP metody s pre- denaturačním krokem bývá přidávána až po takovém kroku [3,19,20]. Existuje několik typů tohoto enzymu, pro amplifikační metody jsou vhodné typy Bst 2.0 DNA polymerasa a Bst 2.0 WarmStart DNA polymerasa [21]. 2.1.4 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček pro detekci Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae (HI) je gramnegativní kokobacil [22]. Jeho typ b je původcem menigitidy a zápalu plic u dětí a ročně si celosvětově vyžádá odhadem 520 000 obětí [23]. První pokus o zavedení metody LAMP pro detekci HI typu b byl zaznamenán v roce 2011 Dong Wook Kimem a kolektivem [24]. Bylo navrženo pět „primerů“ zacílených do 17 oblasti „kapsulárního lokusu II“ a pro detekci amplifikačních produktů byla použita turbidimetrická metoda. Limitní množství kopií genomu HI typu B, které bylo ještě možné touto metodou řádně detekovat bylo stanoveno na 10 (v případě PCR to bylo 103) [24]. V roce 2017 byl Chika Takanou a kolektivem navržen multiplexový LAMP pro detekci HI sérotypů a, c, d, e a f [25]. Pro každý sérotyp byla navržena šestice „primerů“ zacílených do oblasti „kapsulárních lokusů“ specifických pro každý sérotyp. Limitní množství kopií genomů HI sérotypu a, c, d, e a f, které bylo ještě možné touto metodou řádně detekovat bylo stanoveno na 102, 102, 102, 103 a 10 v tomto pořadí [25]. V roce 2018 bylo Owenem Higginsem a kolektivem vyvinut multiplexový LAMP pro detekci hlavních původců meningitidy - Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a HI [26]. V této metodě byl navržen inovativní způsob detekce LAMP za použití Thermus thermophilus endonukleasy IV (Tth endonukleasa IV), enzymu štěpícího dvoukláknouvou DNA v abazických místech. Pro každý z patogenů byl kromě šestice běžných „primerů“ (cílených do genu pstA) navržen ještě modifikovaný FIP, který krom běžné nukleotidové sekvence obsahoval v místě F1c fluorescenční molekulu (pro každý patogen jiný) a „zhášeč fluorescence“ (stejný pro všechny patogeny). Mezi fluorescenční molekulu a „zhášeč fluorescence“ bylo vloženo abazické místo. Poměr mezi běžným FIP a modifikovaným FIP byl v reakční směsi 1:1. Dokud nebyl v amplifikační reakci F1c navázán na F1 docházelo „zhášečem fluorescence“ k inhibici fluorescence. Pokud ovšem F1 a F1c vytvořil vazbu za vzniku smyčky, došlo k rozpoznání abazického místa Tth endonukleasou IV a odštěpení fluorescenční molekuly od zbytku FIP – fluorescence již nebyla inhibována a bylo emitováno záření (viz Obrázek 4, strana 19). Vzhledem k tomu, že Tth endonukleasa IV neštěpí jednovláknovou DNA, byla zajištěna fluorescence pouze v případě probíhající amplifikace (díky dvouvláknovému charakteru smyčky). 18 Obrázek 4: Mechanismus detekce LAMP pomocí Tth endonukleasy IV. Cílová sekvence templátové DNA (1). Dosednutí patřičných „primerů“ na rozdělená vlákna (2). Elongace vlákna s F3 „primerem“ vedoucí k disociaci vlákna s FIP „primerem“ (3). Vytvoření smyčky a rozpoznání abazického místa (AM) Tth endonukleasou IV (4). Odštěpení fluorescenční molekuly od FIP se „zhášečem fluorescence“ a emise záření (5). Vytvoření „struktur připomínajících činku“ a rozpoznání abazického místa Tth endonukleasou IV (6). Převzato a upraveno z [26]. Pro eliminování falešně negativních výsledků bylo užito tzv. vnitřní amplifikační kontroly (IAC, z anglického internal amplification control) [26]. Jedná se o molekulu DNA, která bývá přidána do reakční směsi a funguje jako signalizátor inhibice amplifikace [27]. V případě, že je ve směsi přítomné templátové DNA, dochází k amplifikaci jeho cílové sekvence za současné inhibice amplifikace cílové sekvence IAC. V případě absence templátové DNA již není amplifikace IAC inhibována a její následnou detekcí je prokázáno, že důvodem negativní detekce templátové DNA není inhibice amplifikace. V případě popisované LAMP metody bylo pro detekci IAC, stejně jako pro DNA patogenů (výše uvedených), navrženo šest běžných a jeden modifikovaný primer s fluorescenční molekulou a „zhášečem fluorescence“ [26]. Díky tomu, že byly použity čtyři různé fluorescenční molekuly (pro Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, HI a IAC) vykazující fluorescenci při různých vlnových délkách, bylo možné detekovat, jaký z patogenů se konkrétně ve vzorku nachází či jestli se ve vzorku nenachází ani jeden z nich. 19 Limitní množství kopií genomů Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a HI, které bylo ještě možné touto metodou řádně detekovat bylo stanoveno na 39,5; 17,3 a 25,9 v tomto pořadí [26]. Poslední ze známých aplikací LAMP pro detekci HI je komerční kit prodávaný pod názvem eazyplex® CSF direct panel [28]. Je zacílen na detekci šesti nejčastějších původců meningitidy – Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis HI, Escherichia coli, Listeria monocytogenes a Streptococcus agalactiae. Citlivost metody byla stanovena na 90,9 % a specifičnost na 100 %. Pro detekci bylo užito fluorescenční metody. Bližší chemické informace (např. sekvence „primerů“) nebyly uveřejněny. LAMP se pro svou jednoduchost, rychlost a citlivost zdá být ideální metodou pro detekci HI. Další rozvoj metody by mohl vézt k masivní aplikaci v nemocničních zařízeních, zejména těch s omezenými finančními zdroji – například v rozvojových zemích třetího světa, ale také v rámci testů v místě potřeby (ordinace lékařů, domácnosti apod) [29]. 2.2 Další metody amplifikace DNA 2.2.1 Polymerázová řetězová reakce PCR je široce používanou amplifikační metodou ve vědeckých a klinických laboratoří [30]. Je „zlatým standardem“ pro detekci mnoha patogenů. Obecný princip metody, který byl od svého prvního objevu počátkem 80. let postupně zdokonalován, spočívá v amplifikaci DNA zprostředkované cyklickým opakováním tří fází – denaturace, nasedání „primerů a replikace [31]. Cyklus začíná vystavení reakční směsi teplotě přibližně 95 °C, při které dochází k denaturaci DNA. Následuje ochlazení na teplotu přibližně 50–65 °C, při kterém dochází k nasednutí dvou „primerů“ do dvou specifických míst (jedno pro každé komplementární vlákno). Poté je reakční směs ohřáta na teplotu, která je ideální pro aktivitu použité DNA polymerasy a dochází k replikaci DNA. Opakováním cyklů dochází k amplifikaci specifické sekvence DNA ohraničené sekvencemi „primerů“ na 5´ koncích obou vláken. Často používaným enzymem je v PCR metodě Taq DNA polymerasa. Je to enzym izolovaný ze stejnojmenné termofilní bakterie vyskytující se v horkých pramenech [32]. 20 Taq DNA polymerasa vykazuje oproti jiným polymerasam relativně nízkou fidelitu – chybovost se nachází v rozsahu 1–20 ·10-5 [četnost mutace/pár bazí/duplikace] [33]. Rovněž má ale oproti jiným polymerasam vysokou termostabilitu – při teplotě 97,5 °C je za dobu 9 minut inaktivována polovina molekul a teplotní optimum má okolo 75 °C [32,34]. Především díky své termostabilitě našla Taq DNA polymerasa široké uplatnění v metodě PCR. Oproti Bst DNA polymerese používané v metodě LAMP nejeví Taq DNA polymerasa vlákno-nahrazující aktivitu (z anglického strand-displacement activity) [19]. 2.2.2 Amplifikace DNA pomocí nahrazení vlákna nukleové kyseliny Metoda amplifikace DNA pomocí nahrazení vlákna nukleové kyseliny (SDA, z anglického strand displacement amplification) je, obdobně jako LAMP, isotermickou amplifikační metodou a využívá dvou druhů enzymů. Prvním jsou tzv. „poznamenávající“ endonukleasy (angl. nicking endunukleases), které rozštěpí pouze jedno vlákno DNA a druhé nechávají nezměněné (oproti klasickým restrikčním endonukleasam, které štěpí DNA za vzniku dvou dvouvlákných štěpů DNA) [5,35,36]. Druhým enzymem, využívaným v SDA metodě jsou DNA polymerasy, které jsou schopny nahradit vlákno nukleové kyseliny po směru syntézy, jako například Bst DNA polymerasa nebo exo- Klenow DNA polymerasa [35]. V případě SDA nejprve dochází k tepelné denaturaci DNA [5,35]. Následně je teplota snížena a dochází k interakci 4 „primerů“ označených B1, B2, S1 a S2 s DNA (tzv. „nasednutí“). „Primery“ S1 a S2 obsahují ve své nukleotidové sekvenci oblast, kterou jsou schopny detekovat „poznamenávající“ endonuklesy. Za pomocí speciální DNA polymerasy, které je schopna nahradit vlákno nukleové kyseliny po směru syntézy dochází k elongaci vláken s primery S1 a S2 a zároveň k jejich postupnému odštěpení a nahrazení elongujícími vlákny s primery B1 a B2 (viz Obrázek 5, strana 22). Na takto odštěpených vláknech probíhá replikace, čímž se vytváří segmenty dvouvláknové DNA, které na obou koncích obsahují místa rozpoznatelná pro „poznamenávající“ endonukleasy. V dalším kroku tudíž dochází k rozštěpení těchto vláken „poznamenávající“ endonukleasy v místech S primerů a syntéze vláken nových, která pomocí DNA polymerasy předchozí vlákno nahradí. Tento krok se neustále opakuje, čímž v konečném důsledků dochází k tvorbě SDA 21 produktů – namnožených krátkých segmentů vycházející ze specifické sekvence hledaného úseku DNA. Obrázek 5: Princip SDA. Sled reakčních kroků je následující – tepelná denaturace DNA, snížení teploty a nasednutí „primerů“, elongace vláken a odštěpení vláken s S1 a S2 „primery“, replikace na odštěpených vláknech a štěpení jednoho vlákna pomocí „poznamenávající“ endonukleasy. Následně se cyklicky opakuje štěpení a elongace vláken a dochází k tvorbě SDA produktů. Zelená a žlutá oblast na S1 a S2 „primerech“ jsou oblasti, které je schopna detekovat „poznamenávající“ endonukleasa. Převzato z [35] SDA špatně amplifikuje delší segmenty DNA, což je jejím podstatným nedostatkem [35]. To je také důvodem, proč se v širším měřítku v klinické praxi zatím nevyužívá. 2.3 Kontaminace amplifikačních reakcí Navzdory tomu, že je v amplifikačních metodách schopnost v krátkém čase vytvořit velké množství amplifikačních produktů vítanou vlastností, přináší s sebou i značné nebezpečí v případě kontaminace [2,37]. Zdrojem kontaminace mohou být použité chemikálie, kde ke kontaminaci došlo v průběhu výroby, nebo ke kontaminaci může dojít v průběhu manipulace před vlastním experimentem. V druhém případě představuje velké riziko ohromné množství vytvořených amplikonů po předchozích amplifikačních reakcí. Kontaminaci lze do jisté míry zabránit prevencí – oddělením míst, kde dochází k otevírání zkumavek s amplifikačními produkty či k jiné manipulaci s templátovou DNA s místy, kde jsou připravovány roztoky pro amplifikaci; uchováváním laboratorních 22 pomůcek (včetně plášťů) v jedné laboratoři; použitím špiček s filtry či pravidelným čištěním povrchů např. chlornanem sodným (ethanol není pro účely degradace DNA vhodný) [37]. Obecně právě eliminace otvírání zkumavek je zásadní prevencí. S ní souvisí i zvolení vhodné metody detekce amplifikačních produktů (např. gelová elektroforéza není z hlediska kontaminace vhodnou metodou; viz kapitola 2.1.2) [10]. Pokud již ke kontaminaci došlo, lze využít několika chemicko – fyzikálních způsobů, jak jí odstranit. Mezi časté patří degradace DNA pomocí ultrafialového (UV, z anglického ultraviolet) záření (viz kapitola 2.3.1) či použití Uracil-DNA glykosylasy (viz kapitola 2.3.2) [37]. 2.3.1 Vliv Ultrafialového záření na degradaci DNA UV záření poškozuje strukturu DNA několika způsoby. Prvním je tvorba kovalentních vazeb mezipyrimidinovými bázemi (které ve struktuře DNA leží nad sebou) za vzniku cyklobutanových pyrimidinových dimerů nebo pyrimidin-pyrimidon (6-4) fotoproduktů (viz Obrázek 6) [26–28]. Tvorba těchto dimerních struktur vede k inhibici elongace DNA řetězce . O O O O HN NH hν HN NH (1) + O N N O O N N O deoxyribosa deoxyribosa deoxyribosa deoxyribosa O O O OH HN HN hν HN (2) + N O O N O N O N deoxyribosa deoxyribosa deoxyribosa N deoxyribosa Obrázek 6: Reakce dvou deoxythymidinů katalyzovaná UV zářením za vzniku cyklobutanového pyrimidinového dimeru (1) nebo pyrimidin-pyrimidonu (6-4) (2). Druhým způsobem poškození je oxidace bází za tvorby např. 8-hydroxyguaninu [37,38,40]. Pokud se DNA nachází uvnitř buňky, může nastat řada endonukleasových opravných mechanismů, které reagují na poškození DNA struktury vyvolané 23 pyrimidinovými dimery nebo produkty oxidativního působení. Tyto opravy vedou k rozštěpení jednoho nebo obou vláken DNA. Účinnost degradace DNA pro účely dekontaminace produktů amplifikačních reakcí pomocí UV záření je závislá na velikosti oligonukleotidů, výskytu DNA, použité vlnové délce záření, intenzitě záření a čase, po který je materiál nebo chemikálie vystavený záření [37]. Větší oligonukleotidy degradují s vyšší účinností než oligonukleotidy menší, což může být zvláště v případě kontaminace produkty předešlých PCR reakcí limitujícím faktorem. Pod hranící 250 párů bází je pravděpodobnost degradace DNA pomocí UV již poměrně nízká [41]. Molekula DNA rozpuštěná v roztoku je mnohem snáze degradovatelná než „povrchová“ DNA usazená např. na stěnách prázdných zkumavek apod [37,41]. Pro největší účinnost by měl být povrch laboratorních pomůcek, na kterých je zachyceno DNA, vystaven UV záření v kolmém směru ke směru záření. I tak ale nelze vyloučit „stínění“ dalšími látkami usazenými na povrchu, a tak snížení účinnosti degradace. Tento fakt limituje uplatnění UV pro dekontaminaci laboratorních pomůcek [37]. Účinnost degradace pomocí UV záření v oblasti delších vlnových délek (320-400 nm) lze zvýšit přidáním interkalačního isopsoralenu, který inhibuje elongaci [42]. 2.3.2 Uracil-DNA glykosylasa Uracil-DNA glykosylasa (UDG) je hydrolytický enzym patřící do stejnojmenné superrodiny. Katalyzuje odštěpení uracilu z řetězce DNA – výskyt uracilu v DNA je podmíněn buďto samovolnou deaminací cytosinu již přítomného v DNA řetězci nebo chybným zavedením deoxyuridin monofosfátu (dUMP) místo deoxythymidin monofosfátu (dTMP) při syntéze DNA pomocí DNA polymerasy [43,44]. První ze zmíněných procesů vyvolává tvorbu G–U párů, které v následující replikaci mohou vézt ke změně nukleotidové sekvence, a tedy k mutaci. Konkrétně se jedná o záměnu adeninu za guanin na vlákně komplementárním k vláknu, na kterém proběhla deaminace. Záměna thyminu za uracil nevede k tvorbě mutací, ale k narušení interakcí mezi DNA a DNA vaznými proteiny (z anglického DNA binding proteins). Záměrnou inkorporací dUMP do produktů DNA amplifikací a následným zavedením abazických míst pomocí UDG (které v konečném důsledku mohou zabránit replikaci 24 takového úseku DNA) lze významně snížit riziko kontaminace testovaných vzorků produkty předchozích amplifikací [2]. 2.3.2.1 Mechanismus Mechanismus účinku UDG lze rozdělit do dvou fází – hledání substrátu a odštěpení substrátu. Při hledání substrátu využívá UDG pravděpodobně dva druhy „pohybů“ – jednodimenzionální difuzi po DNA řetězci a trojdimenzionální difuzi [43,45]. Jednodimenzionální pohyb je zprostředkován „klouzáním“ nebo „krátkými skoky“. Klouzání je kontinuální pohyb po DNA řetězci a je definovaný tzv. procesivitou, tedy počtem párů bází, kterou je UDG schopné zkontrolovat bez oddisociování z řetězce DNA. Hodnota procesivity je pro UDG relativně nízká – s 50% šancí dojde k oddisociování enzymu před uplynutím délky 30 párů bází [43,45]. Pokud po oddisociování dojde k okamžitému opětovnému navázání v blízké vzdálenosti, hovoříme o krátkých skocích. Pokud dojde k oddisociování, volné difusi v roztoku a následně náhodné vazbě na DNA, hovoříme o trojdimenzionální difuzi. Samotné prohledávání bází probíhá v několika krocích [43,44]. Nejprve se UDG nespecificky váže na DNA, lehce ji „ohýbá“ a „prohledává“ řetězec. Pokud narazí na uracil, dochází k úplnému ohnutí DNA v místě uracilu (pod úhlem 45°) a vazbě interkalační smyčky do oblasti malého žlábku. Ohyb je zprostředkován dvěma smyčkami – jedna způsobuje ohyb vlákna směrem k 5´ konci a druhá ohyb vlákna směrem ke 3´ konci. Následně dochází k navázání uracilu do oblasti specifické vazebné kapsy a nukleofilní substitucí uracilu za vodu je přerušena N-glykosylická vazba mezi uracilem a deoxyribosou. Vzniká tak abazické místo (viz Obrázek 7, strana 26). 25 Obrázek 7: Schéma vzniku abazického místa odštěpením uracilu z nukleotidového řetězce katalytickým působením UDG. 2.3.2.2 Užití Uracil-DNA glykosylasy při amplifikačních reakcích Užití UDG jakožto enzymového způsobu odstranění kontaminace PCR předchozími amplifikačními produkty bylo poprvé popsáno roku 1990 Mary C. Longo a kolektivem [46]. Od té doby nalezla metoda uplatnění mj. i v metodě LAMP [2,47,48]. Před samotnou amplifikací je v reakční směsi deoxythimidin trifosátem (dTTP) z části nebo úplně nahrazeno deoxyuridin trifosfátem (dUTP) [46–49]. Při amplifikaci je dUMP inkorporován do DNA místo dTMP a po vystavení amplifikačních produktů působení UDG dochází k odštěpení uracilu z DNA a vzniku abazického místa. Abazická místa následně blokují činnost DNA polymerasy [50]. Za vysokých teplot (okolo 90 °C) a neutrálního pH navíc dochází k rozštěpení esterové vazby mezi deoxyribosou, na které byl navázán uracil, a fosfátem [51]. Výsledkem je rozštěpení DNA vlákna v abazickém místě a degradace DNA. DNA neobsahující dUMP nechává UDG nepozměněnou – výskyt uracilu tedy funguje jako značení DNA, které již prošlo amplifikací a v případě opětovného výskytu v reakční směsi bude degradováno. Koncentraci dUTP je nutno optimalizovat pro jednotlivé DNA polymerasy. V PCR metodě byla za vyšších koncentrací dUTP zaznamenána inhibice amplifikace vyvolaná pravděpodobně sníženou aktivitou Taq DNA polymerasy vzhledem k dUTP (relativní srovnání s běžným substrátem v podobě dTTP) [49]. V metodě LAMP bývá často z obdobného důvodu inhibice amplifikace nahrazena pouze část dTTP a empiricky je stanoven ideální poměr dTTP ku dUTP pro danou amplifikační reakci [47,48]. 26 Množství amplifikovaného DNA, které v případě kontaminace nové reakce vede k falešné pozitivitě negativních kontrol je pro LAMP bez UDG odhadován na 1 attogram (vyhodnoceno pro LAMP pro Salmonella enterica) [2]. Při použití LAMP v přítomnosti UDG bylo množství amplifikovaného DNA vedoucího k falešné pozitivitě negativních kontrol pozorováno až při množství 1 femtogram (tedy LAMP metoda realizovaná s využitím UDG je cca 1000x méně citlivá k falešné pozitivitě, než v případě LAMP bez UDG). 27 3 Cíle bakalářské práce Byly stanoveny následující cíle bakalářské práce: • Vytvořit souhrn dosavadních vědních poznatků v oblasti DNA amplifikačních reakcí s důrazem na metodu LAMP. • Zavést standardní PCR protokol detekce HI zacílený na gen glpQ, tak jak je používán na pediatrické klinice Radboud University. • Navrhnout LAMP metodu pro detekci HI zacílenou na stejný gen jako standardní PCR stanoveni, tj. gen glpQ, a porovnat efektivitu LAMP amplifikace s metodou PCR • Navrhnout způsoby optimalizace zavedené LAMP metody s důrazem na eliminaci kontaminace, resp. falešné positivity negativní kontroly v delších časových intervalech inkubace • Stanovit ideální poměr koncentrací dTTP ku dUTP pro optimalizovaný LAMP. • Stanovit a porovnat diagnostická okna LAMP bez dUTP a LAMP v přítomnosti dUTP. • Aplikovat UDG jakožto potenciální nástroj boje proti kontaminaci a ověřit vliv UDG na změnu struktury produktů LAMP v přítomnosti dUTP. 28 4 Materiál a metody 4.1 Použité přístroje Centrifuga MiniStar whiteline, VWR Collection Elektroforetická aparatura MultiSUB Maxi, Cleaver Scientific Laminární box BIO 126, Labox Předvážky 440-35N, KERN Suchá lázeň myBlock Mini, BSH200, Benchmark Termocykler CFX connect Real-Time PCR detection system, Bio-Rad Transiluminátor DR-45M, Clare Chemical Research Zdroj na elektroforézu PowerPac Basic Power Supply, Bio-Rad 4.2 Použitý materiál a chemikálie Bio-Rad, USA SsoAdvanced Universal Probes Supermix Fluka, Švýcarsko tris(hydroxymethyl)aminoethan 29 Lach-Ner, Česká republika EDTA; kyselina octová New England BioLabs, USA WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA); 2-Log DNA Ladder; dUTP Solution Pharmacia, Švédsko agarosa Thermo Fisher Scientific™ DNA Gel Loading Dye (6X); Water, nucelase-free; SYBR™ Safe DNA Gel Stain; Uracil-DNA Glycosylase; 10x Reaction Buffer Uracil-DNA Glycosylase Sekvence primerů pro LAMP primer F3: 5´- CGTCTGTGAAAAACTCGG -3´ primer B3: 5´- GGTAAACTATAATTACGATTGGATG -3´ primer FIP (F1c – F2): 5´- CGTTGGTAAAAGAACTTGCACA-ATCTTTACGCACGGTGTA -3´ primer BIP3 (B1c – B2): 5´- TTAACTAACATATACCAACCTGGACC-TTAAACCTGGTGCAATGG -3´ primer FL: 5´- GGATGCACTTCCACATTAT -3´ primer BL: 5´- ATCGGCATATTTAACCACTTCTG -3´ 30 Sekvence primerů pro PCR „forward primer“: 5´- TCTTTTTCTTGTGTTTCTTTCCAATCT -3´ „reverse primer“: 5´- AGTGGTTAAATATGCCGATGGTG -3´ „fluorescenční sonda“: 5´- FAM-AAACATCCAATCGTAATTATAGTTTACCCAATAACCC–BHQ1 -3´ FAM – fluorescenční molekula; Carboxyfluorescein BHQ1 – „zhášeč fluorescence“; Black Hole Quencher 1 4.3 Metody 4.3.1 Horizontální agarosová elektroforéza K navážce 2,20 g agarosy bylo přidáno 200 ml TAE pufru (0,04 mol · dm-3 Tris; 1 mmol · dm-3 Chelaton 3; 0,02 mol · dm-3 acetát) a vzniklá směs byla zvážena. Agarosa byla rozpuštěna ohřevem v mikrovlnné troubě. Následně byl roztok zchlazen proudem tekoucí vody z kohoutku a doplněn na původní hmotnost deionizovanou vodou. K roztoku bylo přidáno 20,0 μl barviva SYBR™ Safe DNA Gel Stain. Roztok byl promíchán a převeden do elektroforetické vaničky. Pomocí dvou hřebenů byly vytvořeny vzorkové jamky ve dvou řadách a směs byla ponechána stát po dobu 45 minut. Vzniklý gel byl v elektroforetické vaničce vložen do elektroforetické aparatury (MultiSUB Maxi, Cleaver Scientific). Elektroforetická aparatura byla po vložení vaničky s gelem naplněna TAE pufrem. Do jamek byla převedena v případě analýzy produktů PCR, respektive LAMP metody, směs 10 μl PCR produktů (kapitola 4.3.2), respektive LAMP produktů (kapitola 4.3.3), ke každému bylo ještě předem přidáno 2 μl 6x gel loading dye. V případě analýzy LAMP produktů v přítomnosti UDG byla přenesena směs 9,43 μl produktů LAMP s přidáním dUTP a UDG (viz kapitola 4.3.5). Standardu bylo přidáno 6,0 μl na jamku (1,0 μl 2-log DNA Ladder; 1,0 μl gel loading dye; 4,0 μl deionizované vody). Elektroforéza byla prováděna při napětí 210 V po dobu 50 minut. Po jejím ukončení byl agarosový gel přenesen na transiluminátor (DR-45M, Clare Chemical Research) a byly pořízeny fotografie separovaných oligonukleotidů. 31 4.3.2 Polymerázovářetězová reakce Nejprve byly pipety, špičky, mikrozkumavky Eppendorf a deionizovaná voda po dobu 30. minut vystaveny UV záření v laminárním boxu (BIO 126, Labox). Poté byla následujícím způsobem připravena směs PCR „primerů“. Do 200 μl mikrozkumavky Eppendorf bylo přidáno 1,5 μl roztoku „forward primeru“, 1,5 μl roztoku „reverse primeru“, 0,75 μl roztoku fluerescenční sondy a 11,3 μl deionizované vody. Vzniklý roztok byl promíchán opětovným nasáváním automatickou pipetou. Pracovní roztok obsahující enzym, deoxynukleotidy a směs PCR „primerů“ byl připraven tak, že do 1,5 ml mikrozkumavky Eppendorf bylo přidáno 10,56 μl směsi PCR „primerů“ připraveného v předchozím kroku, 132 μl SsoAdvanced Universal Probes Supermix a 95 μl deionizované vody. Vzniklý pracovní roztok byl promíchán opětovným nasáváním automatickou pipetou. Vlastní PCR reakce probíhaly v 200 μl tenkostěnných PCR mikrozkumavkách Eppendorf, do kterých bylo převedeno po 9 μl pracovního roztoku (složení viz předchozí odstavec). Do jedné mikrozkumavky Eppendorf byl k tomuto pracovnímu roztoku přidán 1 μl deionizované vody a roztok byl promíchán opětovným nasáváním automatickou pipetou. Tento roztok sloužil jako negativní kontrola. Do dalších mikrozkumavek byl k pracovnímu roztoku přidán 1 μl roztoku DNA bakterie HI o následujících koncentracích – 1 · 10-5 ng/μl; 1 · 10-4 ng/μl; 1 · 10-3 ng/μl; 1 · 10-2 ng/μl; 1 · 10-1 ng/μl; 1 ng/μl a 10 ng/μl a vzniklé roztoky byl promíchány opětovným nasáváním automatickou pipetou. Vzorky templátové DNA HI byly přidávány vždy od nejnižší koncentrace DNA po nejvyšší a mikrozkumavky byly pečlivě uzavřeny předtím, než byl do další mikrozkumavky přidáván roztok o vyšší koncentraci DNA bakterie HI. 32 Tabulka 1: Složení vlastních PCR inkubačních směsí obsahující různé koncentrace templátové DNA bakterie HI a negativní kontroly bez templátové DNA HI Chemikálie Roztok s DNA bakterie HI Negativní kontrola dH2O [μl] 3,9 4,9 FP [μl] 0,04 0,04 BP [μl] 0,04 0,04 fluorescenční sonda 0,02 0,02 SsoAdvanced Universal 5,00 5,00 Probes Supermix [μl] Roztok DNA bakterie HI o 1 0 dané koncentraci [μl] Všechny zkumavky byly krátce centrifugovány na stolní centrifuze (MiniStar whiteline, VWR Collection) a následně vloženy do termocykleru. Podmínky provedení PCR se nacházejí v Tabulce 2. Během jednotlivých cyklů PCR reakce byla automaticky zaznamenávaná fluorescence PCR inkubací. Po uplynutí 50 cyklů PCR byly jednotlivé PCR inkubace analyzovány horizontální agarosovou elektroforézou (viz kapitola 4.3.1) Tabulka 2: Průběh a podmínky PCR detekce DNA HI. Celkem proběhlo 50 cyklů, ve kterých se opakovaly kroky 2 a 3. Krok Teplota [°C] Čas [s] 1. 95 180 2. 95 10 3. 60 20 4.3.3 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček Nejprve byly pipety, špičky, mikrozkumavky Eppendorf a deionizovaná voda po dobu 30 minut vystaveny UV záření v laminárním boxu (BIO 126, Labox). Poté byla následujícím způsobem připravena směs LAMP „primerů“. Do 200 μl mikrozkumavky Eppendorf zkumavky bylo přidáno 1,6 μl roztoku F3, 1,6 μl roztoku B3, 12,7 μl roztoku FIP, 12,7 μl roztoku BIP3, 3,2 μl roztoku FL, 3,2 μl roztoku BL a 44,4 μl deionizované vody. Vzniklý roztok byl promíchán opětovným nasáváním automatickou pipetou. 33 Pracovní roztok obsahující enzym, deoxynukleotidy, acidobazický indikátor a směs LAMP „primerů“ (viz předchozí odstavec) byl připraven tak, že do nové 200 μl mikrozkumavky Eppendorf bylo přidáno 6,9 μl směsi LAMP „primerů“ připraveného v předchozím kroku, 34,5 μl WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix a 23 μl deionizované vody. Vzniklý pracovní roztok byl promíchán opětovným nasáváním automatickou pipetou. Vlastní LAMP reakce probíhaly v 200 μl mikrozkumavkách Eppendorf, kam bylo přidáno po 14 μl pracovního roztoku (viz předchozí odstavec). Do jedné mikrozkumavky Eppendorf byl k tomuto pracovnímu roztoku přidán 1 μl deionizované vody a roztok byl promíchán opětovným nasáváním automatickou pipetou. Tento roztok sloužil jako negativní kontrola. Do dalších mikrozkumavek byl k pracovním roztokům přidán vždy1 μl roztoku templátové DNA bakterie HI o následujících koncentraci – 1 · 10-5 ng/μl; 1 · 10-1 ng/μl a 10 ng/μl a vzniklé roztoky byly promíchány opětovným nasáváním automatickou pipetou. Vzorky templátové DNA HI byly přidávány vždy od nejnižší koncentrace DNA po nejvyšší a mikrozkumavky byly pečlivě uzavřeny předtím, než byl do další mikrozkumavky přidáván roztok o vyšší koncentraci DNA bakterie HI. Tabulka 3: Složení vlastních LAMP inkubačních směsí obsahující různé koncentrace templátové DNA bakterie HI a negativní kontroly bez templátové DNA HI Chemikálie Roztok s DNA bakterie HI Negativní kontrola dH2O [μl] 5,84 6,84 F3 [μl] 0,03 0,03 B3 [μl] 0,03 0,03 FIP [μl] 0,06 0,06 BIP3 [μl] 0,06 0,06 FL [μl] 0,24 0,24 BL [μl] 0,24 0,24 WarmStart® Colorimetric 7,5 7,5 LAMP 2X Master Mix [μl] Roztok DNA bakterie HI o 1 0 dané koncentraci [μl] 34 Mikrozkumavky byly krátce centrifugovány na stolní centrifuze (MiniStar whiteline, VWR Collection) a následně byly reakční směsi inkubovány při teplotě 65 °C (myBlock Mini, BSH200, Benchmark) po dobu 90 minut. V jednotlivých časových intervalech byly mikrozkumavky krátce centrifugovány na stolní centrifuze (MiniStar whiteline, VWR Collection) a ihned po centrifugaci byl pořízen fotografický záznam vzhledu (barvené změny acidobazického indikátoru obsaženého v inkubacích) jednotlivých LAMP inkubací. Po uplynutí 90 minut inkubace byly jednotlivé LAMP inkubace analyzovány horizontální agarosovou elektroforézou (viz kapitola 4.3.1) 4.3.4 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu Nejprve byly pipety, špičky, mikrozkumavky Eppendorf a deionizovaná voda po dobu 30 minut vystaveny UV záření v laminárním boxu (BIO 126, Labox). Poté byla připravena směs „primerů“ pro LAMP stejně jako je popsáno v prvním odstavci kapitoly 4.3.3. Následně bylo do nové 200 μl mikrozkumavky Eppendorf přidáno 26,4 μl této směsi „primerů“, 132,0 μl WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix a 81,0 μl deionizované vody. Vzniklý pracovní LAMP roztok byl promíchán opětovným nasáváním automatickou pipetou. Vlastní LAMP reakce v přítomnosti dUTP probíhaly v 200 μl mikrozkumavkách Eppendorf. Konkrétně inkubace obsahovala vždy 13,6 μl pracovního LAMP roztoku, dále 0,4 μl roztoku dUTP o následujících koncentracích – 100 mmol/dm3; 50,0 mmol/dm3; 25,0 mmol/dm3 a 12,5 mmol/dm3. Následně byly LAMP inkubace nastartovány přídavkem buď 1 μl dH2O nebo 1 μl DNA bakterie HI o následujících koncentracích – 1 · 10-5 ng/μl; 1 · 10-1 ng/μl a 10 ng/μl. 35 Tabulka 4: Složení vlastních LAMP inkubačních směsí v přítomnosti dUTP obsahující různé koncentrace templátové DNA bakterie HI a negativní kontroly bez templátové DNA HI. Chemikálie Roztok s DNA bakterie HI Negativní kontrola dH2O [μl] 5,44 6,44 F3 [μl] 0,03 0,03 B3 [μl] 0,03 0,03 FIP [μl] 0,06 0,06 BIP3 [μl] 0,06 0,06 FL [μl] 0,24 0,24 BL [μl] 0,24 0,24 WarmStart® Colorimetric 7,5 7,5 LAMP 2X Master Mix [μl] Roztok DNA bakterie HI o 1 0 dané koncentraci [μl] Roztok dUTP o dané 0,4 0,4 koncentraci [μl] Mikrozkumavky byly krátce centrifugovány na stolní centrifuze (MiniStar whiteline, VWR Collection) a následně byly reakční směsi inkubovány při teplotě 65 °C (myBlock Mini, BSH200, Benchmark) po dobu 90 minut. V jednotlivých časových intervalech byly mikrozkumavky krátce centrifugovány na stolní centrifuze (MiniStar whiteline, VWR Collection) a ihned po centrifugaci byl pořízen fotografický záznam vzhledu (barvené změny acidobazického indikátoru obsaženého v inkubacích) jednotlivých LAMP inkubací. Po uplynutí 90 minut inkubace následoval postup opsaný v další kapitole (4.3.5.) 4.3.5 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu a uracil-DNA glykosylasy Byly provedeny vlastní LAMP inkubace v přítomnost různých koncentrací dUTP (viz kapitola 4.3.4.) a byly inkubovány při teplotě 65 °C po dobu 90 minut. Poté byly mikrozkumavky dále inkubovány 2 minuty při teplotě 80 °C (myBlock Mini, BSH200, Benchmark) Následně bylo z každé mikrozkumavky odebráno 7,5 μl a přeneseno do prázdných 200 μl mikrozkumavek Eppendorf. Do původních mikrozkumavek bylo přidáno 1,07 μl dH2O a 0,86 μl pufru pro UDG. Do nových mikrozkumavek bylo přidáno 1,07 μl 36 UDG (1 U/µl) a 0,86 μl pufru pro UDG. Vzniklé roztoky byly promíchány opětovným nasáváním automatickou pipetou. Tabulka 5: Složení inkubací pro ošetření LAMP produktů připravených dle návodu v kapitole 4.3.4 ošetřených nebo neošetřených UDG Chemikálie Roztok s UDG Roztok bez UDG dH2O 0 1,07 UDG 1,07 0 Pufr pro UDG 0,86 0,86 Produkty LAMP reakcí 7,5 7,5 v přítomnosti různých koncentrací dUTP a templátové DNA HI Mikrozkumavky byly krátce centrifugovány na stolní centrifuze (MiniStar whiteline, VWR Collection) a následně byly reakční směsi inkubovány při teplotě 37 °C (myBlock Mini, BSH200, Benchmark) po dobu 60 minut. Po uplynutí 60 minut byly jednotlivé inkubace analyzovány horizontální agarosovou elektroforézou (viz kapitola 4.3.1) 37 5 Výsledky 5.1 Polymerázová řetězová reakce pro Haemophilus influenzae Dle kapitoly 4.3.2. byly připraveny vzorky H1 (koncentrace templátové DNA 1 ng/μl), H2 (koncentrace templátové DNA 1 · 10-1 ng/μl), H3 (koncentrace templátové DNA 1 · 10-2 ng/μl), H4 (koncentrace templátové DNA 1 · 10-3 ng/μl), H5 (koncentrace templátové DNA 1 · 10-4 ng/μl), H6 (koncentrace templátové DNA 1 · 10-5 ng/μl), H7 (koncentrace templátové DNA 1 · 10-6 ng/μl) a K1 (negativní kontrola) a byla provedena PCR. Na Obrázku 8 (strana 38) je znázorněna závislost intenzity fluorescence PCR směsí s různým obsahem DNA bakterie HI na počtu cyklů PCR. Z této závislosti je patrné, že vzorky H1 – H6 začaly vykazovat nárůst fluorescence postupně od 14. do 34. cyklu PCR reakce v závislosti na koncentraci templátové DNA bakterie HI. Ve vzorku H1 došlo k nárůstu již během 14. cyklu, ve vzorku H2 během 19. cyklu, ve vzorku H3 během 23. cyklu, ve vzorku H4 během 26 cyklu, ve vzorku H5 během 30. cyklu a ve vzorku H6 během 34. cyklu. Ve vzorku H7 došlo k nárůstu fluorescence až během 38. cyklu, což bylo později než v případě negativní kontroly K1 (bez templátové DNA HI), ve které došlo k nárůstu fluorescence již během cyklu 37. 38 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 0 10 20 30 40 50 -100,00 Počet cyklů H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 K1 c (DNA) 1 1· 10-1 1 · 10-2 1 · 10-3 1 · 10-4 1 · 10-5 1 · 10-6 0 [ng/μl] Ob rázek 8: Závislost intenzity fluorescence PCR směsí s různým obsahem DNA bakterie HI na počtu cyklů PC R (přesné složení inkubací viz Tabulka 1, strana 33). Počáteční koncentrace ve vzorku H1 byla 1 ng/μl, ve vzorku H2 1 · 10-1 ng/μl, ve vzorku H3 1 · 10-2 ng/μl, ve vzorku H4 1 · 10-3 ng/μl, ve vzorku H5 1 · 10-4 ng/μl, ve vzorku H6 1 · 10-5 ng/μl a ve vzorku H7 1 · 10-6 ng/μl. Vzorek K1 byl negativní kontrolou. Závislost dekadického logaritmu koncentrace templátové DNA bakterie HI na počtu cyklů PCR, nutných pro pozorování prvního nárůstu fluorescence vykazuje lineární závislost (viz Obrázek 9). 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 -1 -2 R² = 0,9975 -3 -4 -5 -6 -7 Počet cyklů Obrázek 9: Závislost dekadického logaritmu koncentrace DNA bakterie HI na počtu cyklů PCR (vyhodnocení dat prezentovaných na Obrázku 8). 39 log (c/ng/μl) Intenzita fluorescence Na základě analýzy produktů PCR gelovou elektroforézou (Obrázek 10) je ve drahách, kde byly analyzovány PCR produkty vzorků H1 – H6 patrný výskyt oligonukleotidů o velikosti přibližně 100 párů bází. Je patrné, že míra fluorescence je pro produkty PCR vzorků H1– H4 obdobná. Ve drahách analýzy produktů PCR vzorků H5 a H6 je již patrný pokles míry fluorescence. Ve drahách využitých k analýze produktů PCR vzorků H7 a K1 již fluorescence nebyla pozorována. Obrázek 10: Gelová elektroforéza produktů PCR vzorků obsahující různou koncentraci DNA bakterie HI. Čísla v první dráze (S) vyjadřují velikost jednotlivých složek DNA standardu s uvedením počtu párů bází. Složení jednotlivých roztoků pro PCR analýzu viz Tabulka 1, strana 33. V dráze H1 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 1 ng/μl; v dráze H2 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 1 · 10-1 ng/μl; v dráze H3 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 1 · 10-2 ng/μl; v dráze H4 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 1 · 10-3 ng/μl; v dráze H5 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 1 · 10-4 ng/μl; v dráze H6 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 1 · 10-5 ng/μl; v dráze H7 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 1 · 10-6 ng/μl; v dráze K1 je analyzován produkt PCR, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 0 ng/μl. 40 5.2 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček pro Haemophilus influenzae Dle kapitoly 4.3.3. byly připraveny vzorky L1 (koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-1 ng/μl), L3 (koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-3 ng/μl), L7 (koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-7 ng/μl) a K1 (negativní kontrola, bez přidané templátové DNA). Průběh LAMP reakce jednotlivých vzorků je zaznamenán na Obrázku 11 (strana 41). Před zahájením inkubace (tedy v čase 0 minut) bylo ve všech vzorcích pozorované růžové zbarvení. Stejné zbarvení bylo pozorováno u vzorků až do přibližně 20. minuty. V čase 25 minut bylo již zřetelné oranžové zbarvení vzorku L1, které se do 30. minuty změnilo ve žluté. Po 30. minutě byla pozorována změna z růžového zbarvení na oranžové ve vzorku L3; obdobná změna zbarvení byla zaznamenána souběžně pro vzorky K1 a L7 ve 40. minutě. V čase 45 minut byly již všechny vzorky žluté, nicméně vzorky K1 a L7 měly tmavší barvu než vzorky L1 a L3. V čase 70 minut byly všechny vzorky stejně jasně žluté. Toto zbarvení setrvalo až do ukončení inkubace v 90 minutě. 41 Obrázek 11: Průběh LAMP reakcí v čase 10 (A), 30 (B), 45 (C) a 70 (D) minut. Počáteční koncentrace DNA bakterie HI ve vzorku L1 byla 6,67 · 10-1 ng/μl, ve vzorku L3 6,67 · 10-3 ng/μl a ve vzorku L7 6,67 · 10-7 ng/μl. K1 byla negativní kontrola (přesné složení jednotlivých inkubací viz Tabulka 3, strana 34). Po ukončení LAMP reakce byly případné amplifikační produkty analyzovány gelovou elektroforezou (Obrázek 12, strana 43). Ve všech drahách s amplifikačními produkty LAMP reakcí byla pozorována značná fluorescence po celé délce dané dráhy naznačující přítomnost široké škály oligonukleotidů různých velikostí (tzv. amplikonů). V drahách s produkty LAMP vzorků L1 a L3 lze rozeznat 5 výrazných oligonukleotidů. Ve vzorcích L7 a K1 nelze jednotlivé florescenční signály od sebe rozeznat, nicméně lze konstatovat vyšší míru fluorescence v dolních částech drah. V prostředních drahách (L7, L3 a L1) byla pozorována nižší rychlost pohybu oligonuklotidů než v drahách krajních (K1 a S). 42 Obrázek 12: Gelová elektroforéza produktů LAMP reakcí (po 90 minutách), které byly vizualizovány pomocí acidobazického indikátoru (viz Obrázek 11, strana 42). V dráze L1 je analyzován produkt LAMP, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 6,67 · 10-1 ng/μl; v dráze L3 je analyzován produkt LAMP, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 6,67 · 10-3 ng/μl a v dráze L3 je analyzován produkt LAMP, která amplifikovala DNA bakterie HI o výchozí koncentraci 6,67 · 10-7 ng/μl. K1 byla negativní kontrola (přesné složení inkubací viz Tabulka 3, strana 34). Čísla v prvním sloupci (S) vyjadřují velikost jednotlivých složek DNA standardu s uvedením počtu párů bází. 43 5.3 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček pro Haemophilus influenzae v přítomnosti deoxyuridintrifosfátu Dle kapitoly 4.3.3 a 4.3.4 byly připraveny vzorky K1, L1, L3, L7, K11, L11, L31, L71, K12, L12, L32, L72, K13, L13, L33, L73, K14, L14, L34 a L74 a byly provedeny LAMP reakce. Ve vzorcích obsahujících v názvu „L1“ byla koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-1 ng/μl, ve vzorcích obsahujících v názvu „L3“ byla koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-3 ng/μl a ve vzorcích obsahujících v názvu „L7“ byla koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-7 ng/μl. Vzorky obsahující v názvu „K1“ sloužily jako negativní kontroly (bez templátové DNA). Pravým dolním indexem byla značena koncentrace dUTP ve vzorku. Dolním indexem jedna byly značeny vzorky o koncentraci dUTP 0,34 mmol/dm3, dolním indexem dva vzorky o koncentraci dUTP 0,68 mmol/dm3, dolním indexem tři vzorky o koncentraci dUTP 1,4 mmol/dm3 a dolní indexem čtyři vzorky o koncentraci dUTP 2,7 mmol/dm3. Průběh LAMP reakce jednotlivých vzorků lišících se koncentrací templátové DNA a obsahem dUTP je zaznamenán na Obrázcích 13, 14 a 15 (strany 44, 45 a 46 v tomto pořadí). Před zahájením inkubace (tedy v čase 0 minut) bylo u všech vzorků pozorované růžové zbarvení. Stejné zbarvení bylo pozorováno u vzorků až do přibližně 20. minuty. Mezi 20. a 25. minutou došlo u vzorků L1 a L11 souběžně ke změně růžové na oranžovou, která se v obou případech do 30. minuty změnila na žlutou. Ve 30. minutě bylo také pozorováno oranžové zbarvení ve vzorcích L12, L3 a L31, které se do 45. minuty téměř totožně změnilo na žluté. Ve 45. minutě bylo zaznamenáno oranžové zbarvení ve vzorcích L32 a L13. V 70. minutě byla již pozorována oranžová barva ve vzorcích K1, K11, L71, L72 a L33 a žlutá barva ve vzorcích L32 a L13. Do 90. minuty bylo konstatované žluté zbarvení ve všech vzorcích o koncentraci dUTP rovné nebo menší 0,68 mmol/dm3 (tj. ve vzorcích K1, L1, L3, L7, K11, L1 1, L31, L71, K12, L12, L32, a L72) a ve vzorcích L13 a L33. Ve vzorku K12 bylo v 90. minutě pozorováno oranžové zbarvení. Ve vzorcích K13, L73, K14, L14, L34 a L74 nebyla za 90 minut inkubace zaznamenána změna barvy. 44 Obrázek 13: Průběh LAMP reakcí v čase 10 (A), 30 (B), 45 (C) a 70 (D) minut v přítomnosti různých koncentrací dUTP. Počáteční koncentrace DNA bakterie HI ve vzorku L1 byla 6,67 · 10-1 ng/μl, ve vzorku L3 6,67 · 10-3 ng/μl a ve vzorku L7 6,67 · 10-7 ng/μl. K1 byla negativní kontrola, bez templátové DNA (přesné složení jednotlivých inkubací viz Tabulka 4, strana 36). Ve vzorcích v pravé částí obrázku (značených dolním indexem jedna) se nacházelo dUTP o počáteční koncentraci 0,34 mmol/dm3. 45 Obrázek 14: Průběh LAMP reakcí v čase 10 (A), 30 (B), 45 (C) a 70 (D) minut v přítomnosti různých koncentrací dUTP. Počáteční koncentrace DNA bakterie HI ve vzorku L1 byla rovna 6,67 · 10-1 ng/μl, ve vzorku L3 rovna 6,67 · 10-3 ng/μl a ve vzorku L7 rovna 6,67 · 10-7 ng/μl. K1 byla negativní kontrola, bez templátové DNA (přesné složení jednotlivých inkubací viz Tabulka 4, strana 36). Ve vzorcích v levé částí obrázku (značených dolním indexem dva) se nacházelo dUTP o počáteční koncentraci 0,68 mmol/dm3. Ve vzorcích v pravé částí obrázku (značených dolním indexem tři) se nacházelo dUTP o počáteční koncentraci 1,4 mmol/dm3. 46 Obrázek 15: Průběh LAMP reakcí v čase 10 (A), 30 (B), 45 (C) a 70 (D) minut v přítomnosti dUTP o koncentraci 7,20 · 10-2 mmol/dm-3. Počáteční koncentrace DNA bakterie HI ve vzorku L1 byla rovna 6,67 · 10-1 ng/ μl, ve vzorku L3 rovna 6,67 · 10-3 ng/ μl a ve vzorku L7 rovna 6,67 · 10-7 ng/ μl. K1 byla negativní kontrola, bez templátové DNA (přesné složení jednotlivých inkubací viz Tabulka 4, strana 36). Ve vzorcích značených dolním indexem čtyři se nacházelo dUTP o počáteční koncentraci 2,7 mmol/dm3. 47 5.4 Izotermální amplifikace DNA pomocí smyček pro Haemophilus influenzae s přidáním deoxyuridintrifosfátu a uracil-DNA glykosylasy Dle kapitoly 4.3.5. byly připraveny vzorky L1, L3, L7, K1, L1´, L3´, L7´, K1´, L11, L31, L71, K11, L11´, L31´, L71´, K11´, L32, L72, K12, L32´, L72´ a K12´. Ve vzorcích obsahujících v názvu „L1“ byla koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-1 ng/μl, ve vzorcích obsahujících v názvu „L3“ byla koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-3 ng/μl a ve vzorcích obsahujících v názvu „L7“ byla koncentrace templátové DNA 6,67 · 10-7 ng/μl. Vzorky obsahující v názvu „K1“ sloužily jako negativní kontroly (bez templátové DNA). Pravým dolním indexem byla značena koncentrace dUTP ve vzorku. Dolním indexem jedna jsou značeny vzorky o koncentraci dUTP 0,34 mmol/dm3 a dolním indexem dva vzorky o koncentraci dUTP 0,68 mmol/dm3. Ve vzorcích značených čárkou „´“ se nacházela UDG. Po ukončení LAMP s přidáním dUTP a následnou inkubací s UDG byly produkty amplifikace analyzovány gelovou elektroforézou (přesné provedení experimentu viz kapitola 4.3.5). Ve všech drahách byla zaznamenána fluorescence. V drahách s amplifikačními produkty vzorků bez dUTP (L1, L3, L7, K1, L1´, L3´, L7´ a K1´) nebyl pozorován rozdíl ve fluorescenci mezi drahami s amplifikačními produkty vzorků obsahující UDG (L1´, L3´, L7´a K1´) a vzorky neobsahující UDG (L1, L3, L7 a K1). V drahách s amplifikačními produkty vzorků L1, L3, L1´a L3´ lze rozeznat 3 výrazné oligonukleotidy o přibližné velikosti 500, 400 a 300 párů bází. V drahách s amplifikačními produkty vzorků v přítomnosti 0,34 mmol/dm3 dUTP bez následného ošetření UDG (L11, L31, L71 a K1 1) lze pozorovat obdobnou míru fluorescence jako v drahách s amplifikačními produkty vzorků bez dUTP. V drahách s amplifikačními produkty vzorků L11 a L31 už ale nebyly pozorovány výrazné oligonuklotidy o přibližných velikostech 500, 400 a 300 párů bází jako tomu bylo u vzorků L1, L3, L1´a L3´. V drahách s amplifikačními produkty vzorků v přítomnosti 0,68 mmol/dm3 dUTP bez následného ošetření UDG (L32, L72 a K12) byla v porovnání s drahami amplifikačních produktů vzorků o stejné počáteční koncentraci templátové DNA HI ale nižší či nulové koncentraci dUTP pozorována menší míra fluorescence. 48 V drahách s amplifikačními produkty v přítomnosti 0,34 mmol/dm3 dUTP (L11´, L31´, L71´ a K11´) nebo 0,68 mmol/dm3 dUTP (L32´, L72´ a K12´) následně ošetřenými UDG bylo pozorované oranžové zbarvení. Intenzita tohoto oranžového zbarvení byla nižší než intenzita žlutého zbarvení v drahách s amplifikačními produkty vzorků o stejné počáteční koncentraci dUTP, ale bez UDG (porovnání L11´ s L11, L31´ s L31 apod.). Obrázek 16: Gelová elektroforéza produktů LAMP reakcí (po 90 minutách), které byly vizualizovány pomocí acidobazického indikátoru (viz Obrázek 13, strana 45). Počáteční koncentrace HI DNA ve vzorku L1 byla 6,67 · 10-1 ng/μl, ve vzorku L3 6,67 · 10-3 ng/μl a ve vzorku L7 6,67 · 10-7 ng/μl. K1 byla negativní kontrola (přesné složení inkubací viz Tabulka 3, strana 34). Čísla nalevo od prvního sloupce (S) vyjadřují velikost jednotlivých složek DNA standardu s uvedením počtu párů bází. Ve vzorcích značených dolním indexem jedna (dráhy 10–15) se nacházelo dUTP o počáteční koncentraci 0,34 mmol/dm-3. Ve vzorcích značených čárkou „´“ (dráhy 6–9, 11, 13 a 15) se nacházela UDG (detailní složení inkubací viz Tabulka 5, strana 37). 49 Obrázek 17: Gelová elektroforéza produktů LAMP reakcí (po 90 minutách), které byly vizualizovány pomocí acidobazického indikátoru (viz Obrázky 13 a 14, strany 45 a 46). Počáteční koncentrace HI DNA ve vzorku L1 byla rovna 6,67 · 10-1 ng/μl, ve vzorku L3 rovna 6,67 · 10-3 ng/μl a ve vzorku L7 rovna 6,67 · 10-7 ng/μl. K1 byla negativní kontrola (přesné složení inkubací viz Tabulka 3, strana 34). Čísla nalevo od prvního sloupce (S) vyjadřují velikost jednotlivých složek DNA standardu s uvedením počtu párů bází. Ve vzorcích značených dolním indexem jedna (dráhy 3 a 4) se nacházelo dUTP o počáteční koncentraci 0,34 mmol/dm-3. Ve vzorcích značených dolním indexem dva (dráhy 5–10) se nacházelo dUTP o počáteční koncentraci 0,68 mmol/dm-3. Ve vzorcích značených čárkou „´“ (dráhy 2, 4, 6, 8, 10) se nacházelo UDG (detailní složení inkubací viz Tabulka 5, strana 37). 50 6 Diskuse V době globální pandemie onemocnění covid-19 je více než kdy jindy jasná poptávka po specifické, rychlé, levné a lehce proveditelné metodě detekce patogenů. Metodě, která je nezávislá na klinických laboratořích a jejich vybavení, a kterou lze provádět v místě a čase potřeby. Díky rozvoji amplifikačních metod v posledních dekádách už není splnění této poptávky nepředstavitelné. Mimo jiné by taková metoda pomocí rychlé detekce původce nemocí a následné zacílené léčbě sehrála roli i na poli prevence proti antibiotikové rezistenci bakteriálních patogenů. Zásadním příspěvkem této bakalářské práce je proto zavedení inovativní alternativní metody LAMP pro detekci patogenní bakterie HI, která by v budoucnu mohla sloužit jako nástroj rychlé analýzy vzorků pacienta a s tím spojenou aplikaci adekvátních antibiotik, vůči kterým bakterie nevykazuje rezistenci, a naopak zamezení podání antibiotik, pokud se o bakteriální infekci nebude jednat. Pro srovnání efektivity a senzitivity detekce HI LAMP metodou byla využita v praxi rutinně používaná metoda PCR. V naši laboratoři byl úspěšně zaveden standardní PCR protokol, včetně „primerů“, pro PCR detekci HI tak, jak se rutinně provádí na pediatrické klinice Radboud University, Nizozemí. Také jako zdroj templátové DNA HI byly využity bakteriální lyzáty dodané laboratoří dr. Mariena De Jonge ze stejného pracoviště. Výsledky z PCR detekce HI nejsou ve většině případů překvapivé – závislost mezi dekadickým logaritmem koncentrace templátové DNA a počtem PCR cyklů nezbytných pro pozorování nárůstu fluorescence byla dle očekávání shledána jako lineární. Rychlost odezvy fluorescenčního signálu byla tedy úměrná hodnotě koncentrace templátové DNA HI. Námi použité templátové DNA HI bylo shledáno jako vhodný modelový systém pro následný výzkum LAMP metody. Jako nečekanou lze ovšem označit pozitivní fluorescenční odezvu ve vzorku negativní kontroly (bez vědomě přidané templátové DNA HI), která korelovala i s výsledky analýzy produktů amplifikace gelovou elektroforézou (Obrázek 10, strana 40). Důvodem této pozitivity se zdá být kontaminace vzorků před provedením PCR. Vzhledem ke znalosti dat z vědeckých publikací se domníváme, že podstatným zdrojem kontaminace by mohli být amplifikované DNA z předchozích PCR reakcí [37,46,49]. Nárůst fluorescence ve vzorku 51 negativní kontroly o cyklus dříve než ve vzorku H7 (koncentrace templátové DNA 1 · 10-6 ng/μl) se zdá být pouze dílem statistické pravděpodobnosti (v některých experimentech byl pozorovaný opačný trend). Podobná rychlost fluorescenční odezvy u negativní kontroly a vzorku H7 ale vede k nastavení intervalu koncentrací templátového DNA, ve kterém lze vzorky pomocí PCR metody správně detekovat – vzorek o koncentraci templátové DNA rovné nebo nižší 1 · 10-6 ng/μl už nelze detekovat, protože množství templátového DNA je obdobné jako množství kontaminujícího DNA. Jako mez detekce standardního PCR protokolu pro DNA HI zavedeného do naší laboratoře lze považovat koncentraci templátové DNA 1 · 10-5 ng/μl a navrhujeme vyhodnocení PCR metody uzavřít po 35 cyklech – další pokračování analýzy již není schopno bezpečně rozlišit mezi pozitivním a negativním vzorkem. Jak už bylo zmíněno v úvodním odstavci diskuse, hlavním cílem této bakalářské práce bylo navrhnout, vyvinout a aplikovat LAMP metodu pro detekci DNA HI. Podobný cíl si už v minulých letech kladly některé vědecké skupiny (viz kapitola 2.1.4), ovšem pokud je nám známo, nikdy nebyla vyvinuta LAMP metoda pro detekci HI zacílena na gen glpQ [24–26]. S důrazem na snadnost a přístrojovou nenáročnost metody byla zvolena detekce pomocí acidobazického indikátoru (viz kapitola 2.1.2), která je založena na principu změny barvy indikátoru v závislosti na elongaci DNA řetězce, při které dochází k uvolňování pyrofosfátu při zapojení deoxynukleotidu do vznikajícího řetězce a tím k okyselování roztoku [14]. Námi použitý acidobazický indikátor (obsažený v komerčně dostupném „kitu“ WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) v případě probíhající amplifikace, a tedy snižování pH, změnil nejprve barvu z růžové na oranžovou a následně z oranžové na jasně žlutou. Vzorky se žlutým zbarvením byly klasifikovány jako pozitivní, zatímco růžově zbarvené vzorky byly klasifikovány jako negativní. Vzorky s oranžovým zbarvením byly klasifikovány jako „podezřelé z pozitivity“. Analýzou průběhu LAMP byla nalezena očekávaná závislost mezi koncentrací templátové DNA HI a časem změny barvy acidobazického indikátoru – čím vyšší byla koncentrace templátové DNA, tím dříve docházelo ke změně barvy (Obrázek 11, strana 42). V případě nejkoncentrovanějších vzorků k barevné změně, a tedy identifikaci jejich pozitivity došlo již po 30. minutě. Navržené LAMP „primery“ komplementární ke stejnému genu HI, na 52 který cílí také rutinní stanovení PCR byly shledány vhodnými pro správné provedení LAMP. Obdobně jako v PCR metodě také i v případě LAMP ovšem docházelo k falešně pozitivní odezvě negativních kontrol (bez vědomě přidané templátové DNA HI). Ke změně barvy acidobazického indikátoru docházelo současně ve vzorku negativní kontroly i ve vzorku L7 (koncentrace templátové DNA HI 6,67 · 10-7 ng/μl) přibližně po 40. minutě inkubace (v některých experimentech později). Zajímalo nás, jestli důvodem pozitivní odezvy u negativních kontrol nemůže být okyselení vzorku jinou než amplifikační činností (kupříkladu rozpouštění vzdušného oxidu uhličitého v roztoku). Tato hypotéza ale byla vyloučena po analýze výsledků z gelové elektroforézy produktů daných LAMP reakcí (Obrázek 12, strana 43), kde pozorujeme přítomnost široké škály oligonukleotidů. Je tedy pravděpodobné, že všechny vzorky mohly být kontaminovány malým množstvím DNA HI (podobně jako PCR viz výše), které se neprojevilo při analýze vysokých koncentrací cílových sekvencí, ale v případě negativní kontroly nebo nejnižších testovaných koncentrací templátové DNA HI již toto může hrát významnou roli. Limit detekce nově navržené metody LAMP pro detekci DNA HI se pohybuje nad hranicí 6,67 · 10-7 ng/μl templátové DNA HI, nižší koncentraci templátové DNA již nejsme schopni rozlišit od kontaminace, respektive od negativní kontroly. Na základě této úvahy bylo stanoveno přibližné diagnostické okno LAMP metody, tedy čas inkubace, ve kterém jsme s jistotou schopni změnu barvy acidobazického indikátoru spojit se správnou pozitivitou vzorku. Pokud by došlo ke změně barvy po tomto časovém úseku, není již možné rozlišit falešnou pozitivitu negativní kontroly způsobenou kontaminací od správné pozitivity vzorku o příliš nízké koncentraci templátové DNA. Spodní hranice diagnostického okna byla stanovena na čas inkubace, ve kterém dojde ke stanovení pozitivity vzorku o nejvyšší koncentraci templátové DNA (6,67 · 10-1 ng/μl), tedy cca ve 30. minutě, a horní hranice na dobu, ve které dojde ke stanovení pozitivity negativní kontroly (bez templátové DNA), tedy cca ve 45. minutě (viz obrázek 11, strana 42). Diagnostické okno bylo tedy stanoveno na 15 minut. Usuzujeme, že limit detekce LAMP nebyl nižší než v metodě PCR. V té byl limit detekce stanoven na 1 · 10-13 g templátové DNA (vzhledem k rozdílným objemům reakční směsi nelze koncentrace srovnávat, nutný přepočet na gramy). Nicméně přesné stanovení limitu detekce LAMP bude předmětem dalších studií. 53 Porovnáním výsledků gelových elektroforéz produktů amplifikací PCR a LAMP metody (Obrázky 10 a 12, strany 40 a 43) byla potvrzena enormní efektivita amplifikace LAMP. Obtížně viditelný jediný významný produkt amplifikace v případě gelové elektroforézy PCR produktů (Obrázek 10, strana 40) kontrastuje se směsí různě velkých produktů amplifikace po celé délce drah v případě gelové elektroforézy LAMP produktů (Obrázek 12, strana 43). Navíc míra fluorescence koreluje s množstvím daných produktů amplifikace a v případě LAMP je tento parametr o několik řádu vyšší než v případě analýzy produktů PCR. Tato efektivita amplifikace LAMP reakce s sebou ovšem přináší i značné riziko v podobě kontaminace aktuálně analyzovaných vzorků produkty předchozích amplifikačních reakcí [2]. Vědomi si tohoto rizika a ve snaze rozšířit diagnostické okno navržené LAMP metody detekce DNA HI, jsme zkoumali metody boje proti kontaminaci. Domnívali jsme se, že ideálním nástrojem boje proti kontaminaci by mohla být kombinace vystavení laboratorních pomůcek a deionizované vody UV záření (před přípravou LAMP) [37] a zavedení LAMP metody za přítomnosti dUTP a UDG [2,47,48]. Efektivita degradace amplifikačních produktů a tím následná možnost snížit riziko kontaminací pomocí dUTP a UDG byla dále experimentálně studována. Řada autorů uvádí, že přítomnost dUTP při amplifikačních reakcích vykazuje inhibiční vlastnosti vůči použité DNA polymerase [47–49]. Proto jsme se rozhodli další část experimentů věnovat optimalizaci koncentrace dUTP, přičemž koncentraci dTTP (ani dalších deoxinukleotidů) jsme v reakční směsi neměnili (1,4 mmol/dm3). Cílem bylo nalézt takovou koncentraci dUTP, při které bude docházet pouze k malému snížení efektivity amplifikace, ale zároveň bude dostatečná pro signifikantní inkorporaci uracilů do amplifikačních struktur (pro efektivní další působení UDG). Dle očekávání byl pozorován kauzální vztah mezi množstvím přidaného dUTP a mírou inhibice LAMP. Ve vzorcích o koncentraci dUTP 2,7 mmol/dm3 a 1,4 mmol/dm3 byla pozorována příliš velká inhibice amplifikace (Obrázky 14 a 15, strana 46 a 47), a proto byly vzorky z dalších experimentů vyřazeny. Ve vzorcích o koncentraci dUTP 0,68 mmol/dm-3 (přibližně poloviční množství vhledem k přítomnému množství dTTP) byla inhibice polymerasy pozorována také, nicméně ve znatelně menší míře než v případě vyšších koncentrací dUTP. Domnívali jsme se, že takové snížení efektivity by bylo pro naše účely přijatelné a mohlo by mít i pozitivní dopad v podobně rozšíření diagnostického okna. Diagnostické okno bylo pro LAMP bez 54 přítomnosti dUTP a v přítomnosti 0,34 mmol/dm3 dUTP stanoveno přibližně na 15 minut. Tento interval se v přítomnosti 0,68 mmol/dm3 dUTP rozšířil velmi vítaným směrem na přibližně 45 minut. Tento fakt by mohl být zásadní pro vlastní aplikaci LAMP metody do praxe a pomoci s bezpečným odlišením správně pozitivních vzorků od falešně pozitivních kontaminovaných vzorků. Ve vzorcích o počáteční koncentraci dUTP 0,34 mmol/dm-3 (přibližně čtvrtinové množství vhledem k přítomnému množství dTTP) nebyla pozorována inhibice LAMP. Vzorky o počátečních koncentracích dUTP 0,68 mmol/dm-3 a 0,34 mmol/dm3 byly shledány z hlediska inhibice LAMP jako ideální pro další zkoumání. Pro zkoumání účinku UDG na redukci kontaminace bylo využito gelové elektroforézy. Vzorky LAMP produktů z inkubací bez dUTP a s dUTP o počátečních koncentracích 0,68 mmol/dm3 a 0,34 mmol/dm3 byly rozděleny na poloviny. K polovině byla přidána UDG a k druhé polovině stejný objem deoinizované vody. Dle očekávání na vzorky bez dUTP neměla UDG žádný vliv (Obrázek 16, strana 49). Toto zjištění je zásadní, protože inkubace testovaných vzorků před vlastní LAMP analýzou s UDG neovlivní amplifikaci vlastní testované sekvence DNA. Pouze v drahách s produkty amplifikačních reakcí v přítomnosti 0,68 mmol/dm3 nebo 0,34 mmol/dm3 dUTP a následně ošetřených UDG bylo pozorováno nezvyklé oranžové zbarvení amplifikačních produktů. Vzhledem k tomu, že ve vzorcích obsahujících pouze dUTP, pouze UDG nebo neobsahujících ani dUTP ani UDG nebylo toto oranžové zbarvení pozorováno, usuzujeme kauzální vztah mezi současnou přítomností dUTP a UDG v reakční směsi a nezvyklou oranžovou fluorescencí obvykle žlutého SYBR™ Safe DNA Gel Stain po interkalaci do struktury DNA. Domníváme se, že pozorované oranžové zbarvení indikuje změnu ve strukturách oligonukleotidů. Pravděpodobnou změnou se zdá být tvorba abazických míst (viz kapitola 2.3.2) [2,46], které svou činností UDG vytváří v těch místech, kde byl místo thyminu inkorporován uracil. Frekventovaný výskyt abazických míst by mohl přispět ke změně vlastností interkalačního barviva. Dle informací výrobce není SYBR™ Safe DNA Gel Stain vhodný pro detekci jednovláknové DNA. Je tudíž dokonce možné, že by výskyt abazických míst mohl přispět i ke vzniku DNA zlomů a posléze jednovláknových struktur DNA a tedy, že by v případě částečně jednovláknového charakteru produktů amplifikace v přítomnosti dUTP a UDG docházelo ke změně a snížení fluorescence, které jsme pozorovali. Předpokládáme, že takto pozměněné oligonukleotidy již budou schopny pouze omezené 55 replikace v případě kontaminace [2], nicméně další doplňující experimenty budou předmětem budoucích studií. Vzhledem k pozorování oranžového zbarvení amplifikačních produkty vzniklých v přítomnosti 0,68 mmol/dm3 i 0,34 mmol/dm3 dUTP a následně ošetřených UDG bylo usouzeno, že obě tyto koncentrace vedou k signifikantní inkorporaci uracilů do amplifikačních struktur (Obrázky 16 a 17, strany 49 a 50). Optimální koncentrace se tedy nejspíše nachází v intervalu ohraničeném těmito dvěma hodnotami. Přesné určení hodnoty záleží na definování požadavků kladených na LAMP metodu – pokud je požadavkem širší diagnostické okno i za cenu větší časové náročnosti bude lepší zvolit hodnotu bližší hodnotě koncentrace 0,68 mmol/dm3; pokud je požadavkem malá časová náročnost i za cenu užšího diagnostického okna bude lepší zvolit hodnotu bližší koncentraci 0,34 mmol/dm3. V obou případech jsou hodnoty koncentrací dUTP vzhledem k hodnotě koncentrace dTTP (1,4 mmol/dm3) v porovnání s jinými studiemi poměrně nízké – dle některých autorů se poměr dUTP:dTTP pohybuje mezi hodnotami 2:3 až 1:1 [47,48]. Námi získané hodnoty se ale pohybují mezi poměry přibližně 1:2 až 1:3. Důvody takto relativně nízké koncentrace dUTP oproti jiným studiím mohou souviset s různou specifitou použitých enzymů a délkou jejich inkubace se vzorky. Bližší studium optimální koncentrace dUTP, koncentrace UDG, doby a teploty inkubace vzorků s UDG a přesné stanovení míry degradace amplifikačních produktů s inkorporovaným uracilem po vystavení UDG bude předmětem dalšího zkoumání. Shrnutím dosažených výsledků se zdá, že nová LAMP metoda s „primery“ zaměřenými na stejnou sekvenci DNA HI, jako rutinně používaná PCR metoda je velmi citlivou metodou detekce HI, nicméně je tento přístup zatížen velkým rizikem falešné pozitivity negativních vzorků. Po bližším seznámením se s problematikou kontaminace jsme navrhli následující kroky – vystavení laboratorních pomůcek a deionizované vody UV záření (před přípravou LAMP) a zavedení LAMP metody za přítomnosti dUTP a UDG pro eliminaci kontaminace amplifikačních produktů z přechozích reakcí. 56 7 Závěr Předmětem zájmu bakalářské práce bylo studium a optimalizace LAMP metody jakožto nástroje detekce HI. Stanovené cíle bakalářské práce byly splněny (podrobněji viz níže). • Byl vytvořen souhrn dosavadních vědních poznatků v oblasti amplifikačních reakcí s důrazem na metodu LAMP. • Byla úspěšně zavedena standardní PCR metoda detekce HI zacílená na gen glpQ, tak, jak je rutinně používána na pediatrické klinice Radboud University. • Byla úspěšně navrhnuta a testována LAMP metoda pro detekci HI zacílená na gen glpQ. Efektivita amplifikace byla v LAMP metodě pozorována vyšší než v PCR. • Zavedená metoda byla optimalizována. Pro eliminaci kontaminace byla navržena kombinace vystavení laboratorních pomůcek a deionizované vody UV záření (před vlastní LAMP) a zavedení LAMP metody za přítomnosti dUTP a UDG. • Bylo stanoveno rozmezí poměrů mezi koncentracemi dUTP a dTTP, při kterém dochází k signifikantní inkorporaci uracilů do amplifikačních produktů a zároveň k omezené míře inhibice LAMP – ideální koncentrace dUTP byla stanovena jako přibližně čtvrtinová až poloviční vůči koncentraci dTTP. • Diagnostické okno bylo pro LAMP bez přítomnosti dUTP i pro LAMP v přítomnosti 0,34 mmol/dm3 dUTP stanoveno přibližně na 15 minut. Tento interval se v přítomnosti 0,68 mmol/dm3 dUTP rozšířil přibližně na 45 minut. • Ve vzorcích s produkty LAMP v přítomnosti dUTP byla po inkubaci s UDG pozorována změna struktury amplifikovaných oligonukleotidů. Zdá se, že takto pozměněné oligonukleotidy již budou schopny pouze omezené replikace v případě kontaminace. Na vzorky amplifikačních produktů LAMP bez dUTP neměla UDG žádný pozorovatelný vliv, a proto pravděpodobně inkubace testovaných vzorků před vlastní LAMP analýzou s UDG neovlivní amplifikaci testované sekvence DNA. 57 Seznam použitých zdrojů 1. Wong, Y. ‐P., Othman, S., Lau, Y. ‐L., Radu, S., Chee, H. ‐Y. (2018) Loop‐mediated isothermal amplification (LAMP): a versatile technique for detection of micro‐organisms. J Appl Microbiol 124, 626–43. 2. Hsieh, K., Mage, P.L., Csordas, A.T., Eisenstein, M., Soh, H.T. (2014) Simultaneous elimination of carryover contamination and detection of DNA with uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification (UDG-LAMP). Chem Commun (Camb) 50, 3747–49. 3. Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., Hase, T. (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, e63. 4. Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. (2015) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 53, 1–5. 5. Fakruddin, M., Mannan, K.S.B., Chowdhury, A., Mazumdar, R.M., Hossain, Md.N., Islam, S., Chowdhury, Md.A. (2013) Nucleic acid amplification: Alternative methods of polymerase chain reaction. J Pharm Bioallied Sci 5, 245–52. 6. Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. (2001) Loop-mediated Isothermal Amplification Reaction Using a Nondenatured Template. Clin Chem 47, 1742–43. 7. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. (2002) Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes 16, 223–29. 8. Lau, Y.-L., Lai, M.-Y., Teoh, B.-T., Abd-Jamil, J., Johari, J., Sam, S.-S., Tan, K.-K., AbuBakar, S. (2015) Colorimetric Detection of Dengue by Single Tube Reverse-Transcription-Loop- Mediated Isothermal Amplification. PLoS One 10. 9. Liu, N., Zou, D., Dong, D., Yang, Z., Ao, D., Liu, W., Huang, L. (2017) Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification method for the simultaneous detection of Salmonella spp. and Vibrio parahaemolyticus. Sci Rep 7. 58 10. Shirato, K. (2019) Detecting amplicons of loop‐mediated isothermal amplification. Microbiol Immunol 63, 407–12. 11. Lin, M., Liu, W., Wang, P., Tan, J., Zhou, Y., Wu, P., Zhang, T., Yuan, J., Chen, Y. (2015) Rapid detection of ermB gene in Clostridium difficile by loop-mediated isothermal amplification. J Med Microbiol 64, 854–61. 12. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. (2001) Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun 289, 150–54. 13. Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P.K., Rao, P.V.L., Morita, K. (2008) Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol 18, 407–21. 14. Tanner, N.A., Zhang, Y., Evans, T.C. (2015) Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques 58, 59–68. 15. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. (2008) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc 3, 877–82. 16. Njiru, Z.K. (2012) Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology: Towards Point of Care Diagnostics. PLoS Negl Trop Dis 6. 17. Shirato, K., Semba, S., El-Kafrawy, S.A., Hassan, A.M., Tolah, A.M., Takayama, I., Kageyama, T., Notomi, T., Kamitani, W., Matsuyama, S., Azhar, E.I. (2018) Development of fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) using quenching probes for the detection of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol Methods 258, 41–48. 18. Olmsted, J., Kearns, D.R. (1977) Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids. Biochemistry 16, 3647–54. 59 19. Ignatov, K.B., Barsova, E.V., Fradkov, A.F., Blagodatskikh, K.A., Kramarova, T.V., Kramarov, V.M. (2014) A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification. BioTechniques 57. 20. Chander, Y., Koelbl, J., Puckett, J., Moser, M.J., Klingele, A.J., Liles, M.R., Carrias, A., Mead, D.A., Schoenfeld, T.W. (2014) A novel thermostable polymerase for RNA and DNA loop- mediated isothermal amplification (LAMP). Front Microbiol 5. 21. Tanner, N.A., Zhang, Y., Evans, T.C. (2012) Simultaneous multiple target detection in real- time loop-mediated isothermal amplification. BioTechniques 53, 81–89. 22. Su, Y.-C., Jalalvand, F., Thegerström, J., Riesbeck, K. (2018) The Interplay Between Immune Response and Bacterial Infection in COPD: Focus Upon Non-typeable Haemophilus influenzae. Front Immunol 9. 23. Peltola, H. (2000) Worldwide Haemophilus influenzae Type b Disease at the Beginning of the 21st Century: Global Analysis of the Disease Burden 25 Years after the Use of the Polysaccharide Vaccine and a Decade after the Advent of Conjugates. Clin Microbiol Rev 13, 302–17. 24. Kim, D.W., Kilgore, P.E., Kim, E.J., Kim, S.A., Anh, D.D., Seki, M. (2011) Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Haemophilus influenzae Type b in Cerebrospinal Fluid▿. J Clin Microbiol 49, 3621–26. 25. Takano, C., Seki, M., Kim, D.W., Kilgore, P.E., Fuwa, K., Takahashi, K., Inazaki, T., Hayakawa, S. (2017) Molecular Serotype-Specific Identification of Non-type b Haemophilus influenzae by Loop-Mediated Isothermal Amplification. Front Microbiol 8. 26. Higgins, O., Clancy, E., Cormican, M., Boo, T.W., Cunney, R., Smith, T.J. (2018) Evaluation of an Internally Controlled Multiplex Tth Endonuclease Cleavage Loop-Mediated Isothermal 60 Amplification (TEC-LAMP) Assay for the Detection of Bacterial Meningitis Pathogens. Int J Mol Sci 19. 27. Oikonomou, I., Halatsi, K., Kyriacou, A. (2008) Selective PCR: a novel internal amplification control strategy for enhanced sensitivity in Salmonella diagnosis. Letters in Applied Microbiology 46, 456–61. 28. D’Inzeo, T., Menchinelli, G., De Angelis, G., Fiori, B., Liotti, F.M., Morandotti, G.A., Sanguinetti, M., Posteraro, B., Spanu, T. (2020) Implementation of the eazyplex® CSF direct panel assay for rapid laboratory diagnosis of bacterial meningitis: 32-month experience at a tertiary care university hospital. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 39, 1845–53. 29. Diallo, K., Feteh, V.F., Ibe, L., Antonio, M., Caugant, D.A., du Plessis, M., Deghmane, A.-E., Feavers, I.M., Fernandez, K., Fox, L.M., Rodrigues, C.M.C., Ronveaux, O., Taha, M.-K., Wang, X., Brueggemann, A.B., Maiden, M.C.J., Harrison, O.B. (2021) Molecular diagnostic assays for the detection of common bacterial meningitis pathogens: A narrative review. EBioMedicine 65. 30. Zhu, H., Zhang, H., Xu, Y., Laššáková, S., Korabečná, M., Neužil, P. PCR past, present and future. Biotechniques . 31. Voet, D., Voet, J.G., Pratt, C.W. (2015) in Fundamentals of Biochemistry (Wiley, Hoboken, NJ), s 67–68.4th edition. 32. Lawyer, F.C., Stoffel, S., Saiki, R.K., Myambo, K., Drummond, R., Gelfand, D.H. (1989) Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 264, 6427–37. 33. McInerney, P., Adams, P., Hadi, M.Z. (2014) Error Rate Comparison during Polymerase Chain Reaction by DNA Polymerase. Mol Biol Int 2014. 61 34. Lawyer, F.C., Stoffel, S., Saiki, R.K., Chang, S.Y., Landre, P.A., Abramson, R.D., Gelfand, D.H. (1993) High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5’ to 3’ exonuclease activity. PCR Methods Appl 2, 275–87. 35. Zeng, L., Mukama, O., Lu, X., Cao, S., Lin, D. (2018) in Modulating Gene Expression: Abridging the RNAi and CRISPR-Cas9 Technologies, s 61–82. 36. Kozinski, A.W., Kozinski, P.B., James, R. (1967) Molecular Recombination in T4 Bacteriophage Deoxyribonucleic Acid I. Tertiary Structure of Early Replicative and Recombining Deoxyribonucleic Acid. J Virol 1, 758–70. 37. Borst, A., Box, A.T.A., Fluit, A.C. (2004) False-positive results and contamination in nucleic acid amplification assays: suggestions for a prevent and destroy strategy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 23, 289–99. 38. Ikehata, H., Ono, T. (2011) The mechanisms of UV mutagenesis. J Radiat Res 52, 115–25. 39. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. (1997) Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis 18, 811–16. 40. Rastogi, R.P., Richa, Kumar, A., Tyagi, M.B., Sinha, R.P. (2010) Molecular Mechanisms of Ultraviolet Radiation-Induced DNA Damage and Repair. J Nucleic Acids 2010. 41. Sarkar, G., S. Sommer, S. in Recombinant DNA Part I, Methods in Enzymology. (Academic Press). 1993. Vyd. 42. Rys, P.N., Persing, D.H. (1993) Preventing false positives: quantitative evaluation of three protocols for inactivation of polymerase chain reaction amplification products. J Clin Microbiol 31, 2356–60. 43. Zharkov, D.O., Mechetin, G.V., Nevinsky, G.A. (2010) Uracil-DNA glycosylase: Structural, thermodynamic and kinetic aspects of lesion search and recognition. Mutat Res 685, 11–20. 62 44. Parikh, S.S., Putnam, C.D., Tainer, J.A. (2000) Lessons learned from structural results on uracil-DNA glycosylase. Mutat Res 460, 183–99. 45. Porecha, R.H., Stivers, J.T. (2008) Uracil DNA glycosylase uses DNA hopping and short-range sliding to trap extrahelical uracils. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 10791–96. 46. Longo, M.C., Berninger, M.S., Hartley, J.L. (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93, 125–28. 47. Manajit, O., Longyant, S., Sithigorngul, P., Chaivisuthangkura, P. (2018) Development of uracil-DNA-glycosylase-supplemented loop-mediated isothermal amplification coupled with nanogold probe (UDG-LAMP-AuNP) for specific detection of Pseudomonas aeruginosa. Mol Med Rep 17, 5734–43. 48. He, L., Xu, H. (2011) Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of white spot syndrome virus and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp. Aquaculture 311, 94–99. 49. Pang, J., Modlin, J., Yolken, R. (1992) Use of modified nucleotides and uracil-DNA glycosylase (UNG) for the control of contamination in the PCR-based amplification of RNA. Mol Cell Probes 6, 251–56. 50. Lhomme, J., Constant, J.-F., Demeunynck, M. (1999) Abasic DNA structure, reactivity, and recognition. Biopolymers 52, 65–83. 51. Sugiyama, H., Fujiwara, T., Ura, A., Tashiro, T., Yamamoto, K., Kawanishi, S., Saito, I. (1994) Chemistry of thermal degradation of abasic sites in DNA. Mechanistic investigation on thermal DNA strand cleavage of alkylated DNA. Chem Res Toxicol 7, 673–83. 63