UNIVERZITA KARLOVA Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Studijní program: Biochemie Studijní obor: Biochemie Bc. Dominik Nelic Vliv nových derivátů chinazolinu na signální dráhy muskarinových receptorů Effects of new quinazoline derivatives on signalling pathways of muscarinic receptors DIPLOMOVÁ PRÁCE Školitel: RNDr. Viktorie Vlachová, Ph.D., DrSc. Konzultant: Mgr. Jan Jakubík, Ph.D. Konzultant: doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D. Praha 2021 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne: ………………………. 2 Abstrakt Podtypy muskarinových receptorů M2 a M3 se podílí na přenosu signálu při kontrakci hladkého svalstva v dýchacích cestách a plicích. Nadměrná aktivace muskarinových receptorů je spojována se závažnými onemocněními jako je astma nebo chronická obstrukční plicní nemoc. Proto látky blokující muskarinové receptory již nacházejí využití v léčbě těchto onemocnění, především muskarinoví antagonisté, které mají dlouhodobý účinek v kombinaci s kortikoidy tlumícími zánět a agonisty β2-adrenergních receptorů, které vyvolávají relaxaci hladkého svalstva. Přírodní látky vasicin a vasicinon izolované z hluchavkovité rostliny Adatoda léčivá (Justicia adhatoda), která je historicky používána pro léčbu plicních onemocnění, podporují relaxaci hladké svaloviny. Byla připravena série látek s modifikovaným chinazolinovým skeletem původní struktury vasicinonu, které vykazovaly bronchodilatační aktivitu na izolované průdušnici hlodavců. Cílem této diplomové práce bylo potvrdit, že bronchodilatační účinek čtyř chinazolinových derivátů je zprostředkován blokací muskarinových receptorů, a blíže objasnit mechanismus účinku na muskarinové receptory, provedením vazebné a funkční farmakologické analýzy. Byla potvrzena vazba testovaných chinazolinových derivátů na všechny podtypy muskarinových receptorů M1 až M5. Chinazolinové deriváty blokovaly odpověď vyvolanou agonistou karbacholem u všech podtypů muskarinových receptorů. Bronchodilatační účinek z předběžných experimentů ex vivo s chinazolinovými deriváty je tedy alespoň z části způsoben blokací muskarinových receptorů M2 a M3. Vazebná a funkční analýza dále prokázala alosterický mód interakce chinazolinových derivátů s muskarinovými receptory. S ohledem na strukturní podobnosti s inhibitorem acetylcholinesterasy takrinem byl testován a potvrzen vliv derivátu VN45b na tento enzym. Bylo zjištěno, že při farmakologicky relevantních koncentracích (odpovídajících afinitě k muskarinovým receptorům M2 a M3) nedochází ke snížení aktivity acetylcholinesterasy. Klíčová slova: muskarinový receptor, chinazolin, astma, ChOPN, bronchodilatace, alosterická interakce, acetylcholinesterasa 3 Abstract The M2 and M3 subtypes of the muscarinic receptors are involved in smooth muscle contraction in the airways and lungs. Excessive activation of muscarinic receptors is associated with serious diseases such as asthma or chronic obstructive pulmonary disease. Blocking of muscarinic receptors is already utilized in the treatment of these diseases. Long-acting muscarinic antagonists are used as part of the therapy for these diseases simultaneously with anti-inflammatory corticosteroids and agonists of β2-adrenergic receptors, which induce smooth muscle relaxation. The natural substances vasicine and vasicinone isolated from dull plant Malabar nut (Justicia adhatoda) have been historically used to treat lung diseases, where they stimulate smooth muscle relaxation. Based on modifications of their structures, a series of substances with a modified quinazoline skeleton of the original structure vasicinone was prepared. These substances exert bronchodialtional activity on isolated rodent trachea. The aim of this diploma thesis was to confirm that the bronchodilatory effect of four quinazoline derivatives is mediated by the blocking of muscarinic receptors and also clarify in more detail the mechanism of action on muscarinic receptors. For this purpose, binding and functional pharmacological analysis of four quinazoline derivatives were performed. It has been confirmed that quinazoline derivatives bind to all muscarinic receptor subtypes M1 to M5. Quinazoline derivatives blocked the carbachol agonist-induced response of all subtypes of muscarinic receptors. Thus, the bronchodilatory effect of quinazolines from preliminary ex vivo experiments is at least in part due to the blockade of the muscarinic receptors M2 and M3. Binding and functional analysis further demonstrated the allosteric mode of interaction of quinazoline derivates with muscarinic receptors. Because of the structural similarity to the acetylcholinesterase inhibitor tacrine, the effect of the VN45b derivative on this enzyme was examined. It was found that at pharmacological relevant concentrations (corresponding to its affinity for muscarinic receptors M2 and M3) VN45b does not decrease acetylcholinesterase activity. [IN CZECH] Keywords: muscarinic receptor, quinazolines, asthma, COPD, bronchodilatation, allosteric interactions, acetylcholinesterase [IN CZECH] 4 Poděkování Rád bych poděkoval především RNDr. Viktorii Vlachové, Ph.D., DrSc. a doc. RNDr. Miroslavu Šulcovi, Ph.D. za ochotu, cenné rady a připomínky při vypracování mé diplomové práce. Dále bych rád poděkoval kolegyním a kolegům z oddělení Neurochemie Fyziologického ústavu AV ČR, zejména Mgr. Janu Jakubíkovi, Ph.D. za veškerou pomoc a konzultace při zpracování této práce a Mgr. Aleně Randákové, Ph.D. za seznámení s veškerými technikami z laboratoře Neurochemie. 5 Obsah Seznam zkratek a symbolů................................................................................................8 1 Úvod.............................................................................................................................10 2 Literární přehled...........................................................................................................12 2.1 Muskarinové acetycholinové receptory................................................................12 2.1.1 Struktura a aktivace muskarinového receptoru.............................................13 2.1.2 Možnosti selektivní modulace jednotlivých podtypů muskarinových receptorů.................................................................................................................15 2.1.3 Lokalizace a funkce muskarinových receptorů.............................................17 2.2 Muskarinové receptory v hladké svalovině plic...................................................23 2.2.1 Signální dráhy muskarinových receptorů v hladkém svalstvu.....................23 2.3 Terapeutické využití antagonistů muskarinových receptorů.................................25 2.3.1 Astma.............................................................................................................25 2.3.2 Chronická obstrukční plicní nemoc...............................................................26 2.3.2.1 Léčba astmatu a chronické obstrukční plicní nemoci............................26 2.3.2.2 Strukturní přestavba dýchacích cest a nadměrná tvorba hlenu.............27 2.3.3 Antagonisté muskarinových receptorů v léčbě astmatu a chronické obstrukční plicní nemoci........................................................................................28 2.3.4 Chinazolinové deriváty.................................................................................31 3 Cíl práce........................................................................................................................34 4 Materiály a metody.......................................................................................................35 4.1 Použité chemikálie................................................................................................35 4.1.1 Použitý biologický materiál..........................................................................35 4.2 Použité přístroje....................................................................................................35 4.3 Použité metody......................................................................................................36 4.3.1 Pěstování a sklízení buněk............................................................................36 4.3.2 Příprava membrán.........................................................................................36 4.3.3 Příprava chinazolinových ligandů VN*........................................................37 4.4 Biochemické experimenty....................................................................................38 4.4.1 Stanovení koncentrace proteinů....................................................................38 4.4.2 Vazebné pokusy.............................................................................................38 4.4.2.1 Stanovení exprese muskarinových acetylcholinových receptorů..........38 4.4.2.2 Stanovení afinity chinazolinových ligandů k muskarinovým acetylcholinovým receptorům...........................................................................39 4.4.2.3 Kinetické pokusy...................................................................................39 Kinetický pokus disociace............................................................................39 Kinetický pokus asociace..............................................................................40 4.4.3 Receptorový systém M2+G15 a M4+G15.........................................................40 4.4.4 Stanovení koncentrace vápenatých iontů......................................................41 4.4.5 Stanovení vlivu nových chinazolinových ligandů na aktivitu acetylcholinesterasy...............................................................................................42 4.4.6 Vyhodnocování dat........................................................................................42 5 Výsledky.......................................................................................................................46 5.1 Exprese a vazebné vlastnosti jednotlivých podtypů muskarinových acetylcholinových receptorů v membránách CHO buněk..........................................46 5.2 Afinita testovaných chinazolinových derivátů k muskarinovým receptorům.......47 6 5.3 Měření hladiny vápenatých iontů v buňkách pomocí fluorescenčně značené sondy FURA-2/AM v přítomnosti látek VN14a a VN45b.........................................49 5.4 Kinetické pokusy u látek VN14a a VN45b...........................................................53 5.5 Vliv ligandu VN45b na acetylcholinesterasu........................................................54 6 Diskuze.........................................................................................................................56 7 Závěr.............................................................................................................................61 Seznam použité literatury................................................................................................62 Přílohy.............................................................................................................................74 I Syntéza chinazolinových derivátů VN14a, VN15a, VN45b a VN122c...................74 7 Seznam zkratek a symbolů ACh – acetylcholin AChE – acetylcholinesterasa AMP – adenosin monofosfát APP – β-amyloid prekruzorový protein cAMP – cyklický adenosin monofosfát (AMP) CBC - karbachol CHO – vaječník křečíka čínského – z angl. chinese hamster ovary CNS – centrální nervový systém DAG – diacylglycerol DMEM – Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium DR – poměr dávek – z angl. dose ratios DTNB – kyselina 5,5‘-dithiobis-2-nitrobenzoová EDTA – ethylendiamintetraoctová kyselina GPCR – receptory spřažené s G-proteiny – z angl. G-protein coupled receptors ChOPN – chronická obstrukční plicní nemoc HEPES – 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina ICS – inhalační kortikosteroidy – z angl. inhaled corticosteroids IP3 – inositol-1,4,5-trifosfát KHB – Krebsovo médium pufrované HEPES – z angl. Krebs-Hepes buffer LABA – dlouhodobě působící agonista β2-adrenergního receptoru – z angl. long acting beta agonist LAMA – dlouhodobě působící antagonista muskarinového recepotru – z angl. long acting muscarinic antagonist LD50 – koncentrace, která způsobí úhyn 50 % testované populace mAChR – muskarinové acetylcholinové receptory MAPKs – mitogenem aktivované protein kinasy NMS - N-methylskopolamin NOS – NO syntasa PBS – fosfátový pufr – z angl. phosphate buffer saline PEI – polyethylenimin 8 PIP2 – Fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát PLC – fosfolipasa C 9 1 Úvod Muskarinové receptory patří do skupiny receptorů spřažených s G-proteiny (GPCR, z angl. G-protein coupled receptors), na které v současné době cílí více než čtvrtina prodávaných léčivých přípravků. GPCR jsou největší a nejrozmanitější skupinou receptorů na povrchu buněk. Muskarinové acetylcholinové receptory se rozdělují na 5 podtypů označovaných jako M1 až M5, přičemž jednotlivé podtypy mají rozdílnou funkci a liší se výskytem v organismu [1]. Ligandy muskarinových receptorů se mohou vázat jak v ortosterickém vazebném místě, kam se váže přirozený muskarinový agonista acetylcholin, tak v oblastech alosterických. Ortosterické vazebné místo je v rámci jednotlivých podtypů muskarinových receptorů velice podobné, a tudíž je problematické najít látky, které by se selektivně vázaly pouze k některému z podtypů. Alosterická vazebná oblast naopak tak konzervovaná není, a proto alosterické ligandy mohou dosáhnout větší podtypové selektivity. Po vazbě agonisty na receptor dochází k interakci s G-proteinem vedoucí ke spuštění signální kaskády, která má vliv na další procesy v lidském organismu, jako je například kontrakce hladké svaloviny, a to buď přímo aktivací muskarinového receptoru M3 v dýchacích cestách, nebo nepřímo po aktivaci muskarinového receptoru M2 [2]. Muskarinové receptory M1 a M4 hrají roli v paměťových a poznávacích procesech a aktivace muskarinových receptorů M5 se uplatňuje v tzv. systému odměny (z angl. rewarding effect) [3]. Muskarinové receptory označené lichými čísly M1, M3 a M5, spouští po aktivaci agonistou signální kaskádu přes G-proteiny typu Gq, s následnou aktivací fosfolipasy C, která štěpí fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (PIP2) na inositol-1,4,5-trifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). IP3 se pak váže na IP3 senzitivní vápníkové kanály a dochází ke zvýšení koncentrace vápenatých iontů v cytosolu, které například zprostředkují kontrakci hladkých svalových buněk. Aktivace muskarinového podtypu M3 vede k sekreci exo- a endokrinních žláz a k tvorbě hlenu v plicní tkáni. Na druhou stranu podtypy muskarinových receptorů označené sudými čislicemi M2 a M4 působí přes G-protein Gi, který inhibuje adenylátcyklasu. Inhibicí adenylátcyklasy se sníží množství cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP). Následně je pak blokována relaxace hladkých svalových buněk, a tím modulována kontrakce hladkých svalových buněk. V plicní tkáni se nejvíce vyskytují podtypy muskarinových receptorů M2 a M3. Antagonisté 10 muskarinových receptorů by tedy při blokaci muskarinového receptoru M2 podpořili relaxaci hladké svaloviny a při blokaci muskarinového receptoru M3 by zablokovali kontrakci a tvorbu hlenu [4]. Astma a chronická obstrukční plicní nemoc jsou dvě závažná plicní onemocnění, která ovlivňují kvalitu života milionů lidí po celém světě. Společnými příznaky těchto dvou nemocí je obstrukce a zánět dýchacích cest. V současné době jsou tyto dvě nemoci léčeny pomocí tří složek – inhalačními kortikosteroidy, které fungují protizánětlivě, a dále dlouhodobě působícími agonisty β2-adrenergních receptorů a dlouhodobě působícími antagonisty muskarinových receptorů, které způsobují relaxaci hladké svaloviny plic [5]. V minulosti bylo zkoumáno mnoho antagonistů muskarinových receptorů, ale v současné době se používá tiotropium kvůli svému dlouhotrvajícímu účinku na muskarinovém receptoru M3 [6]. Vasicinon a vasicin jsou látky obsažené v hluchavkovité rostlině Adatoda léčivá (Justicia adhatoda), která se historicky používala pro léčbu dýchacích potíží. Modifikací těchto látek bylo zjištěno, že je pro bronchodilatační aktivitu látek důležitá struktura chinazolinového skeletu, která může být následně modifikována [7]. Cílem v této práci bylo zjistit, zda se nově syntetizované chinazolinové deriváty váží na muskarinové receptory, zda blokují jejich aktivaci a případně blíže objasnit mechanismus jejich působení na muskarinových receptorech. 11 2 Literární přehled 2.1 Muskarinové acetycholinové receptory Muskarinové acetylcholinové receptory patří mezi receptory spřažené s G-proteiny (GPCR, z angl. G-protein coupled receptors), které se řadí do třídy A – tedy receptory podobné rodopsinu [8]. Přirozeným agonistou muskarinových receptorů je acetylcholin, který je v in vitro/in vivo experimentech zastupován strukturním analogem karbacholem. Muskarinové receptory jsou modulovány i celou řadou přírodních látek, jako například agonistou muskarinem, alkaloidem z muchomůrky červené (Amanita muscaria), podle něhož získali svůj název, nebo muskarinovými antagonisty atropinem, alkaloidem obsaženým v rulíku zlomocném (Atropa belladonna) nebo skopolaminem, alkaloidem z blínu černého (Hyoscyamus niger). Je známo celkem pět podtypů muskarinových receptorů, které jsou označovány jako M1, M2, M3, M4 a M5. Tyto podtypy se mezi sebou liší jak v aktivaci signálních drah, funkcemi, které zastávají, tak i výskytem v organismu [1]. Muskarinové receptory označené lichými čísly (M1, M3, M5) jsou přednostně spřaženy s třídou G-proteinů Gq. Navázáním agonisty dojde ke spřažení receptorů s G-proteiny Gq a následné aktivaci fosfolipasy C, která spouští fosfatidylinositol trifosfátovou kaskádu, která vede k rozštěpení fosfatidyl-4,5-bisfosfát (PIP2) na 2 látky: inositol-1,4,5-trisfosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). IP3 se váže na IP3-senzitivní vápníkové kanály v membráně sarkoplazmatického retikula, s následným otevřením těchto kanálů a uvolnění vápenatých iontů do cytoplazmy. DAG je zodpovědný za aktivaci proteinkinasy C, která fosforyluje další molekuly [9]. Sudé podtypy muskarinových receptorů (M2 a M4) jsou přirozeně spřaženy s Gi třídou G-proteinů, které inhibují aktivitu adenylátcyklasy. Inhibicí adenylátcyklasy dojde ke snížení hladiny cyklického AMP (cAMP) [10]. Jednotlivé podtypy muskarinových receptorů mají unikátní rozmístění jak v centrálním, tak i v periferním nervovém systému [11]. V centrálním nervovém systému jsou muskarinové receptory zapojeny do řady vegetativních, senzorických, kognitivních a motorických funkcí. V periferní tkáni zprostředkovávají například stimulace sekrece žláz, snížení tepové frekvence nebo kontrakce hladké svaloviny [12]. Selektivní modulace jednotlivých podtypů 12 muskarinových receptorů prostřednictvím jejich agonistů, modulátorů a antagonistů je proto vysoce žádoucí pro možné terapeutické využití [13]. 2.1.1 Struktura a aktivace muskarinového receptoru Muskarinové receptory se skládají z extracelulárního N-konce, sedmi transmembránových helixů propojených třemi extra a třemi intracelulárními kličkami a intracelulárního C-konce. Muskarinové receptory obsahují tři oblasti vazebných míst. Ortosterické vazebné místo pro přirozeného agonistu acetylcholin se nachází hluboko v receptoru a v rámci všech podtypů je strukturně vysoce konzervované. Alosterická vazebná místa stericky oddělená od ortosterického místa se nachází v extracelulární části a jsou rozmanitější než ortosterické vazebné místo, a proto jsou vhodná pro vazbu selektivních ligandů. V intracelulární části receptoru dochází k interakci s G-proteinem (obrázek 1) [2]. Muskarinové receptory mohou být alostericky modulovány i z jiných míst, např. z membránové oblasti cholesterolem [14]. Obrázek 1: Struktura muskarinového receptoru receptoru M2. Muskarinové receptory obsahují strukturně konzervované ortosterické vazebné místo, kam se váže acetylcholin a řada dalšíchá klasických ortosterických ligandů. V horní části receptoru se nachází méně konzervovaná alosterická oblast, kam se váží ligandy, které mohou být podtypově selektivní. Ve spodní části receptoru dochází k interakci s G-proteinem. Struktura získána z https://www.rcsb.org/ 26.3.2021 (PDB ID: 3UON) [15]. Acetylcholin a řada dalších klasických muskarinových ligandů se váže do vysoce konzervovaného (ortosterického místa) hluboko v transmembránové oblasti receptoru. Aktivace muskarinového receptoru je zahájena vazbou agonisty na receptor v inaktivní 13 konformaci. Dle krystalové struktury aktivního muskarinového receptoru M2 (PDB ID: 4MQS), agonista iperoxo vytvoří vodíkovou vazbu s aminokyselinovým zbytkem N6.52 v transmembránovém helixu TM6 a iontovou vazbu s D3.32 v transmembránovém helixu TM3 [2] (číslování podle Ballesterosové a Weinsteina [16]). Toto číslování je založeno na výskytu vysoce konzervovaných aminokyselinových zbytků mezi všemi zástupci receptorů ve skupině A receptorů spřažených s G-proteiny. Označení tvoří jednopísmenný kód aminokyseliny a 2 číslice, kdy první označuje číslo helixu a druhé označuje pozici relativně k nejvíce konzervovanému aminokyselinovému zbytku, který má vždy číslo 50 – tedy N1.50, D2.50, R3.50, W4.50, P5.50, P6.50 a P7.50. V případě D3.32 se tedy jedná o aspartát na třetím helixu 18 pozic od argininu 3.50, který se nachází na intracelulárním konci tohoto helixu [16]. Po vazbě agonisty se horní části transmembránových segmentů přiblíží k agonistovi (obrázek 2 A, strana 15), čímž dojde ke zmenšení ortosterického vazebného místa [17]. Změny v ortosterickém vazebném místě a v extracelulárních částech receptoru jsou přeneseny do intracelulární oblasti receptoru, která je zodpovědná za interakci s G-proteiny. Děje se tak prostřednictvím přeuspořádání intramolekulárních interakcí na dráze tzv. alosterických komunikačních kanálů (z angl. allosteric pipeline) [18]. Tyto komunikační kanály vedou od oblasti interakce s agonistou do oblasti tzv. iontového zámku na intracelulárním konci TM3. Iontový zámek je tvořen interakcí mezi R3.50 v TM3 a E6.30 v TM6. Při aktivaci receptoru dojde k přerušení této interakce a otevření iontového zámku. Otevření iontového zámku umožní vznik interakce mezi R3.50 a cysteinem na C-konci α-podjednotky G-proteinu. Přeuspořádání molekulárních interakcí je v důsledku pohybu transmembránových helixů TM3, TM5, TM6 a TM7. Transmembránové helixy TM3, TM5 a TM7 se nakloní a TM6 rotuje okolo své podélné osy (obrázek 2 B, strana 15). Díky prolinu P6.50 je TM6 strukturně zalomen. Rotace TM6 vede ke zvětšení vzdálenosti mezi intracelulárními konci TM3 a TM6 (obrázek 2 C, strana 15) a následné tvorbě vazebného místa G-protein [19]. Aktivní konformace muskarinového receptoru je pro každého agonistu specifická. Konformace receptoru se liší úhly mezi jednotlivými TM helixy [20]. 14 Obrázek 2: Aktivace muskarinového receptoru. Struktura muskarinového receptoru v inaktivní konformaci (modrá) a dvě aktivní konformace vyvolané agonistou (žlutá a zlatá) z pohledu extracelulární strany membrány (A), z pohledu průřezu membránou s TM6 v popředí (B) a z pohledu intracelulární strany membrány (C). Po aktivaci dojde k posunutí extracelulárních částí TM6 a TM7 dopředu a TM5 do strany ke zbytku spirálového svazku helixů (A), u TM6 dojde k rotaci a u TM7 dojde k náklonu (B). Intracelulární část TM6 ustupuje dále od středu, TM5 do strany a TM3 s TM7 se posune ke zbytku spirálovitého svazku. Převzato z [21]. 2.1.2 Možnosti selektivní modulace jednotlivých podtypů muskarinových receptorů Kvůli nedostatečné podtypové selektivitě byla řada látek, které cílí na muskarinové receptory, vyřazena z klinických studií, protože vyvolávaly vážné vedlejší účinky ovlivněním ostatních podtypů muskarinových receptorů [22,23]. Bylo nalezeno několik selektivních ligandů, včetně alosterických modulátorů muskarinových receptorů, které vykazují významnou podtypovou selektivitu [24]. Nalezení podtypově selektivních látek modulujících muskarinové receptory otevírá cestu pro jejich terapeutické využití [25]. Při vazbě acetylcholinu a dalších ortosterických agonistů na receptor dochází ke kriticky důležité interakci pozitivně nabité skupiny s aminokyselinou D3.32, která je konzervovaná v rámci všech podtypů muskarinových receptorů. Klíčová úloha aspartátu nebo glutamátu v této pozici v ortosterickém vazebném místě je typická pro všechny receptory spřažené s G-proteiny třídy A. Podobnost ortosterického vazebného místa mezi všemi 5 podtypy muskarinových receptorů je hlavní problém hledání podtypově selektivních ligandů [26]. Ortosteričtí agonisté muskarinových receptorů jsou z pravidla malé molekuly, tudíž je obtížné provést modifikaci těchto látek, aby došlo k významné podtypové selektivitě. V případě antagonistů je nalezení podtypově selektivních látek 15 o něco snazší, protože antagonisté muskarinových receptorů bývají zpravidla větší než agonisté, a tím mají větší možnost interagovat s méně konzervovanými oblastmi receptoru mimo ortosterické vazebné místo. Větší velikost molekuly dává prostor pro větší strukturní modifikace, čímž se opět zvyšuje šance na nalezení podtypově selektivního antagonisty. Antagonisté muskarinových receptorů zpravidla obsahují kvartérní dusík interagující s konzervovaným D3.32 a zároveň většina obsahuje aromatickou skupinu [27]. Výrazné podtypové selektivity dosahují alosterické ligandy. Alosterická oblast, která se nachází na extracelulárních kličkách a koncích TM segmentů muskarinových receptorů, je v rámci jednotlivých podtypů méně konzervovaná, a proto může být vazba ligandů (agonistů, antagonistů, modulátorů) do této oblasti podtypově selektivní [28]. Vazba ligandů do alosterické oblasti muskarinových receptorů je nejvíce prostudována u muskarinového receptoru M2 [29]. Alosterické modulátory po vazbě na receptor ovlivní afinitu ortosterického ligandu k receptoru. Snížení afinity ortosterického ligandu vyvolané alosterickým modulátorem se označuje jako negativní kooperativita, zvýšení afinity se označuje jako pozitivní kooperativita. Nedojde-li ke změně, je interakce označována za neutrální kooperativitu [30]. Stejným způsobem vazba ortosterického ligandu ovlivňuje afinitu alosterického modulátoru. Příklady selektivních antagonistů, které se váží do ortosterického místa, mohou být: M1 selektivní pirenzepin, M2 selektivní AFDX-384 [31] nebo M3 selektivní 4-DAMP [32]. Příkladem pozitivních alosterických modulátorů acetylcholinu na muskarinovém receptoru M1 jsou BQCA [33], VU0029767 a VU0090157 [34]. Příkladem negativních alosterických modulátrů mohou být antagonisté galamin a alkuronium [35]. Příkladem alosterických agonistů působících selektivně na muskarinový receptor M1 mohou být VU0184670 a VU0357017 [36]. Studie cílené mutageneze ukazují na dva aminokyselinové zbytky (W7.35 a Y6.51) v muskarinovém receptoru M2, které jsou zodpovědné za selektivitu alostericky působících látek, jako je alkuronium, brucin nebo kurakurin [37]. Dalším způsobem dosažení podtypové selektivity je využití bitopických ligandů. Jedná se o sloučeniny obsahující dva farmakofory propojené raménkem (z angl. linker), které dokáží interagovat s receptorem jak v ortosterickém místě, tak v alosterické oblasti [38]. Příkladem může být bitopický agonista TBPB, selektivně aktivující muskarinové receptory M1 [39]. Selektivní aktivace jednotlivých podtypů muskarinových receptorů 16 může být dosaženo také pomocí funkčně selektivních agonistů. Jedná se o látky, které se váží na všechny podtypy se srovnatelnou afinitou, ale aktivují jen některé [21]. 2.1.3 Lokalizace a funkce muskarinových receptorů Muskarinové receptory jsou široce rozšířeny v celém lidském organismu a zprostředkovávají mnoho funkcí. Poruchy přenosu signálu muskarinovými receptory jsou často spojovány s celou řadou patofyziologických stavů jak v centrální nervové soustavě, tak na periferii [3]. V tabulkách 1 a 2 jsou shrnuty funkce a lokalizace muskarinových receptorů (tabulka 1, strana 22) a možné farmakologické využití agonistů a antagonistů muskarinových receptorů (tabulka 2, strana 22). Muskarinový receptor M1 je nejvíce zastoupený v oblastech předního mozku (mozková kůra, hipokampus, striatum) [40]. Vzhledem k distribuci má aktivace muskarinového receptoru M1 vliv na učení a paměť [41]. Selektivní M1 agonisté by mohli najít uplatnění při onemocněních spojených s poklesem poznávacích funkcí, včetně demencí vyskytujících se u Alzheimerovy choroby, poruch paměti spojených s věkem nebo kognitivními poruchami spojenými se schizofrenií. Rozsáhlé farmakologické studie potvrzující úlohu muskarinového receptoru M1 v kognitivních funkcích byly podpořeny i studiemi na transgenních myších, které měly vyřazený gen pro M1 receptor a u kterých došlo k narušení procesů podílejících se na tvorbě paměti [42]. Avšak kognitivní pokles u transgenních myší bez M1 receptoru v tomto a dalších zvířecích modelech je překvapivě mírný vzhledem k tomu, jak velký vliv mají antagonisté muskarinových receptorů na poznávání [43]. Výsledky z těchto studií naznačují, že role muskarinových receptorů M1 v poznávání je buď daleko složitější, nebo zde dochází k účasti více než jednoho podtypu muskarinových receptorů. Je možné, že muskarinové receptory M1 nejsou kritické pro formování paměti, ale jsou důležité pro procesy paměti zahrnující interakce mezi mozkovou kůrou a hipokampem jako ukládání paměťové stopy a vybavování vzpomínek [44]. Selektivní aktivace muskarinového receptoru M1 nadále zůstává jako slibný terapeutický cíl léčby Alzheimerovy choroby, poškození paměti související s věkem, nebo kognitivních poruch spojených se schizofrenií. Nalezení selektivních agonistů muskarinového receptoru M1 by mohlo vést ke zlepšení poznávání bez vedlejších účinků způsobených zejména aktivací muskarinových podtypů M2 a M3 na periferii [45–47]. Štěpením 17 pomocí β- a γ-sekretasy vzniká neurotoxický β-amyloid (Aβ), který se akumuluje v mozku pacientů ve formě plaků. Hlavní příčinou toxicity nejsou samotné plaky tvořené β-amyloidem, ale rozpustné malé oligomery β-amyloidu. Štěpení α- a γ- sekretasou je neamyloidogenní [48]. Aktivace muskarinového receptoru M1 podporuje neamyloidogenní štěpení bílkoviny prekurzoru β-amyloidu (APP) pomocí α-sekretasy, čímž se snižuje tvorba β-amyloidu. Nadprodukce peptidu β-amyloidu je podle jedné z hlavních hypotéz klíčovou příčinou vedoucí k Alzheimerově chorobě [49]. Toto zjištění bylo následně potvrzeno u pacientů s Alzheimerovou chorobou, kterým byl podáván funkčně selektivní agonista muskarinového receptoru M1 a M3 cevimelin. Po podání této látky klesla hladina Aβ proteinu [46]. Zároveň bylo zjištěno, že u transgenních myší, u kterých byl vyřazen muskarinový receptor M1 došlo ke zvýšení přeměny β-amyloid prekruzorového proteinu (APP) [50]. Selektivní aktivace muskarinového receptoru M1 je tedy terapeuticky využitelným způsobem léčby Alzheimerovy choroby se dvěma možnými přínosy – zvrácením kognitivních poruch a snížením tvorby amyloidových plaků. Hlavním cílem medicinální chemie je proto identifikovat centrálně působící, silné a selektivní agonisty pro léčbu této nemoci [51]. Muskarinové receptory M2 jsou široce zastoupené jak v centrálním, tak periferním nervovém systému [40]. Nacházejí se na membráně cholinergních neuronů v mozku převážně presynapticky a jejich aktivace vede k inhibici uvolňování acetylcholinu. V centrálním nervovém systému se tyto receptory podílejí na řízení motorických funkcí, termoregulaci a jejich aktivace má i analgetické účinky [52]. Zároveň některé studie naznačují, že selektivní antagonisté muskarinového receptoru M2 mohou být použity jako nový možný způsob pro zlepšení cholinergní funkce v Alzheimerově chorobě, zvlášť v případě, kdy není cholinergní funkce ještě úplně narušena. Příkladem může být série látek podobných piperidinu (př. SCH 72788), které působí jako silní a selektivní antagonisté muskarinového receptoru M2 a byly zkoumány v klinických studiích pro léčbu demence, kde měly příznivé účinky. V současné době je cílem mnoha laboratoří nalézt smíšené antagonisty muskarinového receptoru M2 a agonisty muskarinového receptoru M1, u kterých se předpokládá, že by pro léčbu Alzheimerovy choroby mohli mít ještě lepší účinky [53]. Na periferii jsou muskarinové receptory M2 exprimovány v myokardu, kde zprostředkovávají chronotropní a iontropní účinky acetylcholinu, 18 a podílejí se tak na řízení srdečního rytmu. U myší s chybějícím genem pro muskarinový receptor M2 agonisté ztratili bradykardické účinky (zpomalení srdeční frekvence). Výsledky farmakologických studií a výzkumu transkripce mRNA ukazují, že ostatní muskarinové receptory jsou v této tkáni také exprimovány a všechny se mohou účastnit na modulaci aktivity srdečních iontových kanálů, a tím na funkci srdce [54]. Dále jsou muskarinové receptory M2 ve vysoké míře exprimovány v hladkém svalstvu a modulují jeho kontrakci (viz kapitola 2.2, strana 23 – Muskarinové receptory v hladké svalovině plic). Muskarinové receptory M3 se vyskytují hlavně v periferní tkáni hladké svaloviny a žlázách s vnitřní a vnější sekrecí. Hlavní role muskarinových receptorů M3 je tedy kontrakce hladké svaloviny a sekrece žláz, tedy pocení, slinění a vylučování insulinu [40]. Cevimelin a pilokarpin jsou funkčně selektivní agonisté muskarinových receptorů M3, které byly schváleny pro léčbu xerostomie u Sjögrenova syndromu. Xerostomie je projev neustálé vyschlých úst, což může v důsledku vyvolat bolesti jazyka a sliznic nebo zhoršené polykání a mluvení. Sjögrenův syndrom je autoimunitní onemocnění s projevy xerostomie [55]. Selektivní antagonisté muskarinových receptorů M3 mohou najít uplatnění při léčbě inkontinence, astmatu a hyperaktivitě močového měchýře. Příkladem mohou být látky darifenacin nebo zamifenacin, které jsou schváleným lékem pro léčbu inkontinence a hyperaktivního močového měchýře [56]. Aktivace muskarinového receptoru M3 může také vést k fosforylaci cytoplasmatické kličky a C-konce receptoru pomocí receptorových kináz spojených s G-proteinem (G-protein coupled receptor kinases, GRKs), což vede následně k vazbě β-arestinu k fosforylované části receptoru. β-arestiny byly původně považovány za mediátory receptorové desensitizace a internalizace (vstupování do buněk), která vede ke zmenšení signální odpovědi receptoru. Mnoho studií však potvrzuje, že β-arestiny jsou také spřaženy s několika signálními mediátory, včetně mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAPKs) nebo SRC kinasy [57]. Muskarinové receptory M3 se dále vyskytují v centrální nervové soustavě v hipokampu, kde se účastní procesu učení a paměti pomocí řady fosforylačních kaskád, vyvolané aktivací β-arestinové dráhy. Tato dráha ovlivňuje plasticitu, tj. tvorbu nových výběžků a synapsí, což je proces, který je důležitý ve formování paměťových stop [58]. V případě vyřazení muskarinového receptoru M3 19 v mozku u myší došlo k projevu dwarfismu, který se projevuje výraznou hypoplasií přední hypofýzy a snížení množství růstového hormonu a prolaktinu. Tato data ukazují na možnou roli muskarinových receptorů M3 při růstu a vývoji, a proto by muskarinové receptory M3 mohly hrát roli v léčbě poruch vývoje [59]. Muskarinové receptory M4 jsou přítomny převážně v centrální nervové soustavě. Spolu s dopaminovými receptory se nachází hlavně ve striatu, kde se podílí především na regulaci uvolňování acetylcholinu a dopaminu. Hrají roli v pohybové aktivitě a chování. Muskarinové receptory M4 mohou hrát klíčovou roli při psychických onemocněních jako je schizofrenie [60]. U myších modelů s chybějícím muskarinovým receptorem M4 lze pozorovat zvýšenou citlivost na fencyklidin (antagonista N-methyl-D-aspartátových (NMDA) receptorů, který vyvolává projevy a příznaky podobné schizofrenii) [61,62]. Muskarinové receptory M4 hrají také roli u Parkinsonovy choroby. Jedná se o neurodegenerativní onemocnění, které lze charakterizovat zpomaleným pohybem, svalovou ztuhlostí, třesem a poruchou rovnováhy. Důvodem je ztráta dopaminergních neuronů ve striatu, což způsobuje nerovnováhu mezi cholinergním a dopaminergním systémem a následnou dominanci systému cholinergního. Neselektivní antagonisté muskarinových receptorů vykazují dobré výsledky při léčbě tohoto onemocnění, ale častým problémem jsou vedlejší účinky těchto látek (jako např. ztráta paměti, sucho v ústech a zácpa). Transgenní myši s chybějícím muskarinovým receptorem M4 vykazují zvýšenou pohybovou aktivitu a zvýšenou dopaminergní aktivitu [63]. S největší pravděpodobností mají striatální muskarinové receptory M4 inhibiční účinek na funkci dopaminového receptoru D1. Proto bylo zkoumáno několik selektivních antagonistů muskarinových receptorů M4 pro léčbu Parkinsonovy choroby. Příkladem mohou být benzoxaziny jako například PD 0298029, který v klinické praxi vykazuje slibné farmakokinetické vlastnosti a dobrou biologickou dostupnost. V periferních tkáních se muskarinové receptory M4 vyskytují v menší míře a hrají roli v inhibici uvolňování acetylcholinu v parasympatikem inervovaných tkáních [64]. 20 Muskarinové receptory M5 jsou přítomny pouze v mozku. Jsou jediným podtypem muskarinových receptorů, který je exprimován na dopaminergních neuronech – struktury zvané substantia nigra pars compacta. Ta zajišťuje hlavní dopaminovou inervaci striata [11]. Aktivace muskarinového receptoru M5 tím usnadňuje striatální uvolňování dopaminu. Předpokládá se ale, že jsou zapojeny i další muskarinové receptory jako například podtyp M4 [65]. Muskarinový receptor M5 je také hlavním podtypem exprimovaným ve ventrální tegmentální oblasti, tkáni, která poskytuje hlavní přísun dopaminu pro část mozku zvanou nucleus accumbens a dalším limbickým oblastem [66]. Tyto oblasti mozku hrají klíčovou roli v procesu závislosti. Selektivní blokace muskarinových receptorů M5 se jeví jako možný přístup léčby závislosti na omamných látkách. Příkladem vlivu muskarinových antagonistů v závislostech může být využití skopolaminu při léčbě závislosti na heroinu [67]. Několik studií naznačuje, že myši s vyřazeným genem pro muskarinové receptory M5 jsou méně náchylné na působení návykových látek, jako je morfin nebo kokain [68]. Látek tlumících signalizaci muskarinových receptorů M5 není mnoho. Příkladem ale může být amiodaron, který je selektivní negativní alosterický modulátor acetylcholinu na muskarinovém receptoru M5 [69]. 21 Tabulka 1: Lokalizace a funkce jednotlivých podtypů muskarinových receptorů M1 až M5 [3]. Podtyp Lokalizace Funkce Mozková kůra Kognitivní procesy, paměť, zpracování APP M1 Interneurony Regulace elektrofyziologické aktivity neuronů Sympatická ganglia Sympatický tonus Mozek Auto-inhibice uvolňování acetylcholinu Srdce Bradykardie M2 Hladké svaly Regulace kontrakce, bronchodilatační efekt Střevo Motilita Mícha Analgesie Žlázy s vnitřní a Spouštění sekrece (např. slinění) vnější sekrecí M3 Hladké svaly Regulace kontrakce, bronchodilatační efekt Střevo Motilita Mozek Kognitivní procesy Auto-inhibice uvolňování acetylcholinu, Regulace M4 Striatum dopaminergní signalizace Mícha Analgesie M5 Substantia nigra Systém odměny Tabulka 2: Muskarinové receptory M1 až M5 působící jako farmakologický cíl [3]. Podtyp Antagonisté Agonisté Parkinsonova choroba Alzheimerova choroba M1 Antikonvulzanty Schizofrenie (kognitivní deficit) Onemocnění spojené s hladkými svaly M (např. Astma, ChOPN, inkontinence) 2 Analgesie Centrálně působící – Alzheimerova ch. Onemocnění spojené s hladkými svaly Diabetes 2. typu M (např. Astma, ChOPN, inkontinence) 3 Některé typy kolorektálních nádorů Poruchy tvorby slin Schizofrenie (psychotické M4 Parkinsonova choroba symptomy) Prevence abstinenčních příznaků a vzniku M závislosti 5 Schizofrenie (psychotické symptomy) 22 2.2 Muskarinové receptory v hladké svalovině plic Muskarinové receptory hrají klíčovou roli při kontrakci hladké svaloviny gastrointestinálního, respiračního a močového traktu. Tyto kontrakce jsou zprostředkovány muskarinovými receptory, které jsou lokalizované přímo v buňkách hladké svaloviny. Dlouho se předpokládalo, že kontrakci hladké svaloviny řídí primárně muskarinové receptory podtypu M3. Tento předpoklad vznikl na základě několika studií, které ukazovaly, že potenci podtypově selektivních antagonistů blokovat kontrakci odpovídá afinita k muskarinovému receptoru M3. Jedna z prvních studií autorů Ehlert a spol. (1987) [70] porovnávala posuny EC50 agonistou vyvolané kontraktilní odpovědi, vyjádřené pomocí disociační konstanty (KB) s vazebnými disociačními konstantami (KD) měřené na rekombinantně připravených M1-M5 receptorech. Bylo dokázáno, že hodnoty KB antagonistů se shodují nejlépe s vazebnými afinitami k M3 muskarinovým receptorům. Tyto výsledky jsou tedy v souladu s postulátem, že M3 muskarinové receptory hrají klíčovou roli při kontrakci hladké svaloviny [70]. Později bylo prokázáno, že u myších modelů s vyřazeným genem pro M3 muskarinové receptory dochází k silné inhibici kontrakce [71], ale navíc bylo zjištěno, že u myších modelů s vyřazeným genem pro M2 muskarinové receptory dochází také k inhibici, i když menší než v případě vyřazeného M3 muskarinového receptoru [72]. U myší, které měly vyřazeny oba muskarinové receptory M2 a M3 kontraktilní odpověď v tenkém střevě a močovém měchýři úplně chyběla [73]. V některých tkáních může ale aktivace muskarinového receptoru vést k relaxaci hladké svaloviny. Tento účinek se přisuzuje syntéze nebo uvolňování některých chemických mediátorů. Příkladem může být aktivace muskarinového receptoru na endotelu mnoha periferních krevních cév, kdy dojde k syntéze oxidu dusného, který následně difunduje do svalu a dochází k relaxaci [74]. Dalším příkladem může být aktivace muskarinového receptoru ve svalu, která někdy může stimulovat produkci arachidonové kyseliny, jež způsobuje uvolnění hladké svaloviny [75]. 2.2.1 Signální dráhy muskarinových receptorů v hladkém svalstvu V závislosti na druhu buněk může docházet k různé odpovědi na aktivaci stejných muskarinových receptorů. Například v buňkách hladkého svalstva cév dochází po aktivaci muskarinového receptoru M3 ke zvýšení hladiny vápenatých iontů pomocí 23 aktivace fosfolipasy C a k následné kontrakci, zatímco aktivací stejného muskarinového receptoru M3 ve vaskulárních endoteliálních buňkách je aktivována syntasa oxidu dusnatého (NOS, z angl. NO synthase), čímž dojde k nadprodukci oxidu dusnatého, který vede k relaxaci hladkého svalstva cév [76]. Na kontrakci hladké svaloviny vyvolané parasympatickým neuropřenašečem acetylcholinem se podílí jak muskarinový receptor M3, tak muskarinový receptor M2. Většina tkání hladké svaloviny obsahuje oba muskarinové receptory M2 a M3 v poměru zhruba 4 : 1 [77]. I přes menší expresi hraje M3 muskarinový receptor důležitější roli v kontrakci hladké svaloviny v průdušnicích než muskarinový receptor M2. Aktivací muskarinového receptoru M3 a následné Gq signální dráhy dojde ke spuštění hydrolýzy fosfatidylinositolu bisfosfátu, mobilizaci vápenatých iontů a následné kontrakci. Muskarinové receptory M2 se účastní kontraktilní funkce nepřímo pomocí omezení relaxace vyvolané β-adrenoreceptory, která je způsobena aktivací adenylátcyklasy a zvýšením koncentrace cAMP. Zvýšené množství cAMP inhibuje kinasu lehčího řetězce myosinu a tím zabraňuje kontrakci. Aktivací Gi G-proteinu muskarinový receptor M2 inhibuje adenylátcyklasu a tím omezuje účinek β-adrenoreceptoru (obrázek 3, strana 25) [78,79]. Dále může M2 muskarinový receptor podpořit kontrakci vyvolanou muskarinovým receptorem M3 pomocí inhibice Ca2+-aktivovaného K+ kanálu. Kationty K+ fungují jako inhibiční zpětná vazba na mobilizaci kationtů Ca2+ vyvolanou aktivací muskarinového receptoru M3. Inhibicí výše zmíněného kanálu pomocí aktivace muskarinového receptoru M2 nedojde k negativnímu ovlivnění mobilizace kationtů Ca2+ a tím dojde k větší kontrakci vyvolané muskarinovým receptorem M3 [4]. Na druhou stranu, presynaptický M2 muskarinový receptor na postganglionálních parasympatických neuronech, které inervují hladkou svalovinu dýchacích cest [80], omezuje uvolnění acetylcholinu pomocí inhibice uvolnění vápenatých iontů napěťově řízeným vápenatým kanálem [81,82], což slouží jako negativní zpětná vazba pro kontrolu uvolnění acetylcholinu [83]. Blokace těchto M2 receptorů výrazně posiluje parasympaticky indukované stažení průdušek (bronchokonstrikce). Neuronální M2 muskarinové receptory jsou také méně funkční u pacientů trpících astmatem [84]. 24 Obrázek 3: Schéma signálních drah muskarinových receptorů. Po navázání přirozeného agonisty acetylcholinu k muskarinovému receptoru M3 dojde k aktivaci signální dráhy přes G-protein Gq, s následnou aktivací fosfolipasy C, která štěpí fosfatidylinsositol-4,5-bisfosfátu (PIP2) na inositol-1,4,5-trifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). IP3 se dále váže na IP3-senzitivní receptory na hladkém endoplasmatickém retikulu, a tím se otevřou vápenaté kanály a uvolní se vápenaté ionty do cytosolu, které způsobí kontrakci hladké svaloviny. U muskarinového receptoru M2 se po vazbě přirozeného agonisty acetylcholinu aktivuje signální dráha G-proteinu Gi, která vede k inhibici adenylátcyklasy, vedoucí ke snížení koncentrace cAMP, které umožňuje relaxaci. 2.3 Terapeutické využití antagonistů muskarinových receptorů 2.3.1 Astma Astma je komplexní onemocnění, které může mít jak akutní, tak chronické projevy. Různorodé projevy astmatu jsou dány mnoha faktory jako například věk a pohlaví. Astma je způsobeno obstrukcí dýchacích cest, zánětem dýchacích cest následovaných zvýšenou tvorbou hlenu a zvýšenou aktivitou muskarinové signalizace [5]. Toto onemocnění může vzniknout vlivem řady faktorů od virové infekce respiračních cest v kojeneckém věku [85] až po expozice dráždivým látkám u dospělých jedinců, jako je například tabákový kouř a malé prachové částice [86]. Léčba astmatu je individuální a volí se podle závažnosti. Lze ji hodnotit podle 2 kritérií a to – zhoršení (akutní problém) a riziko (dlouhodobé následky) [87]. U většiny pacientů trpících astmatem dojde k projevu v dětství. Bylo prokázáno, že až 50 % dětí trpí stavy sípání během prvních 3 let života. U některých pacientů tyto stavy odezní (přechodné případy), ale v některých případech jsou tyto projevy trvalé. 25 V některých případech projevy astmatu zmizí před dovršením dospělosti (neatopičtí pacienti) někdy pokračují i v dospělosti (atopičtí pacienti) [88]. 2.3.2 Chronická obstrukční plicní nemoc Chronická obstrukční plicní nemoc (ChOPN) je časté a léčitelné onemocnění, kterému se dá předcházet prevencí, a které i přes nové způsoby léčby stále způsobuje úmrtí pacientů. V roce 2018 byla ChOPN čtvrtým nejčastějším důvodem úmrtí ve Spojených státech amerických [89]. Nejčastějším důvodem vývoje chronické obstrukční plicní nemoci v rozvinutých zemích je tabákový kouř. Závažnost nemoci závisí na množství vykouřených cigaret a délce kouření. To vede k postupné ztrátě funkce plic v důsledku poškození plicních sklípků. Na rozdíl od astmatu je plicní obstrukce u ChOPN nevratná [90]. Studie ukazují, že ChOPN se vyskytuje i u pacientů, kteří nikdy nebyli aktivními kuřáky, ale v porovnání s aktivními kuřáky mají nekuřáci lehčí průběh nemoci, méně příznaků a nižší zátěž systémového zánětu [91]. Většina pacientů, kterým je diagnostikována ChOPN, je ve středním nebo starším věku. Mezi hlavní příznaky patří dušnost a kašel. Chronické omezení dýchacích cest, kterým je ChOPN charakterizována, je způsobeno souhrou souboru méně závažných onemocnění dýchacích cest (jako je například obstrukční bronchitida) a parenchymálním poškozením (plicní emfyzém), jejichž relativní příspěvky se liší u každého pacienta. Chronický zánět způsobuje strukturní změny, zúžení dýchacích cest a zničení plicního parenchymu [92]. 2.3.2.1 Léčba astmatu a chronické obstrukční plicní nemoci Účinnost muskarinových antagonistů při léčbě astmatu a chronické obstrukční plicní nemoci je známá už od počátku 19. století, kdy byl inhalován dým z hořících listů a kořenů Datura stramonium, které obsahují muskarinové antagonisty hyosciamin, atropin a skopolamin, pro léčbu plicních nemocí [6]. Při léčbě astmatu a ChOPN jsou používány dva přístupy léčby: léčba zánětu pomocí kortikosteroidů a léčba zvýšené bronchokonstrikce pomocí kombinace agonistů β2-adrenergních receptorů a antagonistů muskarinových receptorů M3. Antagonisté muskarinových receptorů byli zpočátku považováni za vhodné pouze pro léčbu chronické obstrukční plicní nemoci (ChOPN), ale ne pro astma. Poslední studie prokázaly, že při porovnání antagonisty muskarinového receptoru s dlouhotrvajícím účinkem (LAMA) jako je například 26 tiotropium s dlouhodobě působícím β2 agonistou (LABA) jako je například salmeterol u pacientů trpících na astma jsou dlouhodobě působící antagonisté muskarinových receptorů stejně efektivní jako dlouhodobě působící agonisté β2-adrenergních receptorů [93]. I přes vysokou účinnost při léčbě astmatu bylo tiotropium původně vyvíjeno a následně schváleno pro léčbu chronické obstrukční plicní nemoci [94]. V poslední době jsou studovány deriváty tiotropia, jako například glykopyrronium nebo umeklidinium, v podpůrné léčbě astmatu u pacientů, kteří mají zhoršený průběh nebo přetrvávající astmatické symptomy i přes optimalizovanou léčbu pomocí inhalačních kortikosteroidů (ICS, z angl. inhaled corticosteroids) a dlouhodobě působících β2-agonistů (LABA) [95]. Evropská společnost pro respirační onemocnění (z angl. European Respiratory Society) ale navrhla použití tiotropia jako doplňku k ICS/LABA u pacientů se závažným astmatem bez ohledu na projevy [96]. Dlouhodobě působící antagonisté muskarinových receptorů jsou nyní schváleny, nebo ve vývoji pro léčbu astmatu jako jednotný inhalační přípravek, který se skládá z kombinace LAMA, LABA a ICS [95]. 2.3.2.2 Strukturní přestavba dýchacích cest a nadměrná tvorba hlenu Jedním z následků astmatu je strukturní přestavba dýchacích cest, která se projevuje metaplázií pohárkových buněk respiračního systému, zhušťování hladkého svalstva dýchacích cest a ukládáním subepiteliálního kolagenu [97]. Pomocí počítačové tomografie bylo ukázáno, že tiotropium (dlouhodobě působící antagonista muskarinových receptorů) v kombinaci s vhodným dlouhodobě působícím agonistou β2-adrenergních receptorů a inhalačním kortikosteroidem snižuje šířku stěny dýchacích cest [98]. Bylo také dokázáno, že opakovaně vyvolaná bronchokonstrikce pomocí metacholinu (agonisty muskarinových receptorů) u pacientů s astmatem, která se provádí pro zjištění odpovědi plic pacientů na vnější podněty, potvrdila zvýšenou aktivitu buněk produkujících hlen a hladinu subepiteliálních indikátorů pro strukturní přestavbu dýchacích cest. Tento fakt se neprojevil u kontrolní skupiny pacientů a navíc bylo možné tento jev zvrátit podáním albuterolu (agonista β2-adrenergních receptorů). Z toho lze vyvodit, že nadměrná bronchokonstrikce, kterou lze pozorovat u pacientů s astmatem, vede ke strukturním změnám dýchacích cest a k nadměrné produkci hlenu, 27 která způsobí další obstrukci dýchacích cest. U astmatu se primárně provádí léčba zánětů pomocí glukokortikoidů, které však nesnižují bronchiální hyperaktivitu, ale potlačují pouze zánět. U pacientů se závažnějším průběhem astmatu je proto nutná komplexnější terapie, vedoucí ke snížení jak bronchokonstrikce, tak zánětu, aby nedocházelo k nepříznivým důsledkům strukturní přestavby dýchacích cest [99]. 2.3.3 Antagonisté muskarinových receptorů v léčbě astmatu a chronické obstrukční plicní nemoci Nejstaršími antagonisty muskarinových receptorů izolovanými z rostlin byly alkaloidy atropin a skopolamin (obrázek 4A a 4B, strana 29). Jsou to neselektivní antagonisté muskarinových receptorů. Jejich podání za účelem blokování kontrakce hladké svaloviny je provázeno závažnými vedlejšími účinky. Potence atropinu jako bronchodilatátoru závisí na způsobu podání. Pokud je atropin podáván nitrožilně, je zapotřebí daleko většího množství pro vyvolání požadovaného účinku, než pokud je podáván inhalačně. Nezáleží však na způsobu, jakým je vyvolána bronchokonstrikce, ať už jde o vyvolání intravenózně acetylcholinem, nebo inhalovaným metacholinem. Zároveň bylo zjištěno, že inhalovaný atropin není dostatečně účinný pro blokaci kontrakce vyvolané uvolňováním acetylcholinu parasympatikem [100]. Kvůli nedostatečné účinnosti atropinu (a dalších anticholinergních látek) u pacientů, kteří mají astma nebo ChOPN, se předpokládalo, že zvýšené uvolňování acetylcholinu z parasympatiku nezpůsobuje cholinergní hyperaktivitu u těchto nemocí. Později se ukázalo, že se jedná spíše o problém s dávkou atropinu, která je klinicky podávána a která je příliš malá (ED50 = 0,67 mg kg-1 pro blokaci 50 % muskarinových receptorů v plicích). V případě dospělého člověka o 70 kg je ED50 rovna 47 mg. LD50 (koncentrace, která způsobí úhyn 50 % testované populace) atropinu je sice 453 mg, ale už při 10-20 mg dochází k paralýze, takže farmakologicky efektivní dávka atropinu je velmi blízko k toxické dávce) [101]. 28 Obrázek 4: Struktury atropinu (A) a skopolaminu (B). Nakresleno v programu MarvinSketch. Ipratropium (obrázek 5) je syntetická sloučenina obsahující kvartérní dusík s isopropylovou skupinou na atomu dusíku atropinu. Ipratropium blokuje všechny podtypy muskarinových receptorů s podobnou afinitou. Kvůli svojí špatné absorpci při inhalaci je ale zaručeno cílení hlavně na muskarinové receptory v plicích a působí tudíž méně vedlejších účinků než atropin, který se snadněji dostává do krevního řečiště. Příkladem může být to, že inhalované ipratropium neovlivňuje tepovou frekvenci. Díky nízké orální absorpci je také možné zajistit, aby bylo až 90 % aerosolové dávky efektivně využito v plicích. Podobně jako je tomu u atropinu, i v případě ipratropia je potřeba daleko větší dávka než je doporučená maximální dávka bez vedlejších účinků. Doporučená maximální dávka ipratropia je limitovaná na 18 µg. Při větším množství dochází k vedlejším účinkům, ale podávaná dávka pro pacienty trpící ChOPN je zhruba 36 µg. Vedlejší účinky ipratropia jsou většinou mírné, příkladem může být sucho v ústech. Proto byla často předepisována větší dávka ipratropia, protože i přes vedlejší účinky byl vliv ipratropia pro pacienty s ChOPN významný [102]. Obrázek 5: Strukutra ipratropia. Nakreslena v programu MarvinSketch. 29 Tiotropium (obrázek 6) je první anticholinergní látka, která efektivně léčí zanedbané astma [103]. Při podání této látky spolu s kortikosteroidy bylo prokázáno, že je účinek léčby astmatu lepší, než pokud byly použity kortikosteroidy samotné. Tiotropium je strukturně podobné ipratropiu (obrázek 5), ale má významně vyšší afinitu k muskarinovým receptorům [104]. Tiotropium má podobnou afinitu ke všem muskarinovým receptorům, ale na rozdíl od ipratropia má tiotropium kinetickou selektivitu pro muskarinový receptor M3. To znamená, že déle působí na muskarinovém receptoru M3. Tiotropium disociuje z muskarinového receptoru M2 až 10× rychleji než z muskarinového receptoru M3 [105]. Dlouhodobé působení tiotropia je přisuzováno dvěma thiofenovým kruhům v jeho struktuře [106]. Tiotropium díky jeho prodlouženému působení na muskarinovém receptoru M3 ulevuje od dýchacích potíží daleko více než při použití ipratropia. Navíc dlouhotrvající účinek tiotropia umožňuje podávání pouze jednou denně [107]. Tiotropium také více zpomalovalo zhoršování stavu pacientů při chronické obstrukční plicní nemoci než ipratropium, pokud bylo podáno spolu s kortikosteroidy [108]. Obrázek 6: Strukutra tiotropia. Nakresleno v MarvinSketch. Aklidinium (obrázek 7, strana 31) je anticholinergní látka, která obsahuje stejně jako tiotropium dva thiofenové kruhy a kvartérní amoniovou skupinu [109]. Stejně jako tiotropium má aklidinium kinetickou selektivitu pro muskarinový receptor M3 oproti M2. Poločas působení je asi o 5 hodin kratší oproti tiotropiu, ale nástup účinku je rychlejší [110]. Pomocí hydrolas v plasmě dochází k přeměně na neaktivní metabolity cca za 2,4 min. Tato rychlá přeměna v plasmě zajišťuje potlačení vedlejších účinků [111]. 30 Obrázek 7: Struktura aklidinia. Nakresleno v MarvinSketch. Glykopyrolát (obrázek 8) je antagonista muskarinového receptoru M3 s mírně (3-5×) vyšší afinitou než je afinita k muskarinovým receptorům M1 a M2, ale oproti aklidiniu a tiotropiu postrádá kinetickou selektivitu. V chirurgii je používán na potlačení nechtěné bradykardie a k redukci tvorby slin [112]. Obrázek 8: Struktura glykopyrolátu. Nakresleno v MarvinSketch. 2.3.4 Chinazolinové deriváty Řada přírodních látek slouží jako zdroj nových léčiv pro farmaceutický průmysl [113]. Vasicin a vasicinon (obrázek 9, strana 32) jsou hlavní alkaloidy izolované z rostliny Adatoda léčivá (Justicia adhatoda) známé pro své bronchodilatační účinky [114]. Několik laboratoří se zabývalo modifikací struktury vasicinonu. Jednalo se hlavně o modifikace na C-kruhu obsahující stereogenní uhlík. Příkladem může být 31 odebrání hydroxylové skupiny [115], rozšíření kruhu [116] nebo přeměna C kruhu na heterocyklus [117]. Z těchto analogů bylo zjištěno, že látky obsahující sedmiuhlíkatý C kruh a alkoxy substituenty A kruhu byly účinnější při vyvolání relaxace v porovnání s teofylinem jako standardem, což je látka spadající do skupiny methylxantinů, které se dříve používaly pro léčbu respiračních nemocí [118]. Obrázek 9: Strukutry vasicinu (A) a vasicinonu (B). Struktury byly kresleny pomocí programu MarvinSketch Z předchozích studií bylo prokázáno, že kruh C (obrázek 9) může být výrazně modifikován nebo naprosto odstraněn. Kruh C byl proto nahrazen alkylovým řetězcem, který napodobuje strukturu pomocí N3, C4-O, C4-S a C4-N, jak již bylo popsáno Špulákem a spol., 2014. Nové látky vycházejí ze struktury chinazolinového skeletu (obrázek 10). Tyto nové látky vykazují na izolované průdušnici potkana vyšší účinnost v blokování kontrakce než vasicinon nebo teofylin a zároveň nízkou toxicitu. V této diplomové práci se zabývám studiem mechanismu působení 4 derivátů chinazolinu (obrázek 11, strana 33). Dvě struktury (VN14a a VN15a) byly publikovány Špulákem a spol. 2014 a dva deriváty (VN45b a VN122c) byly nově připraveny [7]. Obrázek 10: Strukutra chinazolinu, ze které bylo vycházeno při tvorbě látek VN14a, VN15a, VN45b a VN122c. 32 Obrázek 11: Struktura chinazolinových derivátů použitých v diplomové práci. VN14a a VN15a byly publikovány Špulákem a spol. 2014 [7] a VN45b a VN122c jsou nově syntetizované deriváty. V předběžných experimentech provedených doktorem M. Špulákem z Farmaceutické fakulty v Hradci Králové byla pomocí karbacholu (agonista muskarinových receptorů) vyvolána kontrakce izolované myší průdušnice v přítomnosti a nepřítomnosti chinazolinového derivátu VN14a a VN15a. Oba deriváty zvýšily dávku karbacholu potřebnou pro vyvolání stejné kontrakce izolované průdušnice. Toto zjištění naznačuje, že by mechanismus interakce těchto derivátů mohl působit přes muskarinové receptory. Zároveň byl provedený test na β-adrenergní receptory, které byly také signifikantně ovlivněny chinazolinovými deriváty ve prospěch efektu relaxace, což může znamenat, že tyto chinazolinové deriváty nejenže blokují muskarinové receptory, ale také aktivují β-adrenergní receptory [7]. 33 3 Cíl práce • Ověřit vazbu chinazolinových derivátů na muskarinové receptory. ▪ Pomocí rovnovážných vazebných pokusů s [3H]-N-methylskopolaminem ([3H]-NMS) určit afinitu k jednotlivým podtypům muskarinových receptorů. • Určit mód interakce chinazolinových derivátů s muskarinovými receptory. ▪ Pomocí kinetický pokusů stanovit vliv chinazolinových derivátů na kinetiku vazby [3H]-NMS. • Ověřit, že chinazolinové deriváty antagonizují funkční odpověď muskarinových receptorů. ▪ Prostřednictvím stanovení změny koncentrace nitrobuněčných Ca2+ iontů určit vliv chinazolinových derivátů na karbacholem (agonista muskarinových receptorů) vyvolanou aktivaci muskarinových receptorů. • Stanovit možný inhibiční vliv na acetylcholinesterasu (AChE). ▪ Stanovit aktivitu AChE v přítomnosti chinazolinových derivátů. 34 4 Materiály a metody 4.1 Použité chemikálie 3H-N-methylskopolamin (3H-NMS) specifická aktivita: SRA: 80 Ci/mmol (ARC, USA) Atropin (Sigma-Aldrich, USA) Butyrát sodný (Sigma-Aldrich, USA) DMEM médium - Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma-Aldrich, USA) Geneticin (Sigma-Aldrich, USA) Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) (Serva, Německo) Folinovo činidlo (Folin-Ciocalteau) (P-Lab, USA) Fosfátový pufr (PBS) (Sigma-Aldrich, USA) Fura-2/AM (ThermoFisher, USA) Hepes (Sigma-Aldrich, USA) HMN pufr – 20 mM Hepes; 100 mM NaCl; 10 mM MgCl2; pH = 7,4 Hovězí fetální sérum (Sigma-Aldrich, USA) Karbachol (Sigma-Aldrich, USA) KHB (Krebs Hepes Buffer) – 136 mM NaCl; 4 mM KCl; 1,2 mM MgCl2; 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM Na-HEPES; pH = 7,4 NaCl (Sigma-Aldrich, USA) NaOH (Penta, ČR) MgCl2 (Sigma-Aldrich, USA) Polyethylenimin (PEI) (Sigma-Aldrich, USA) Scintilační roztok Rotiszint (Roth, Německo) Trypsin – 5 g/l (Sigma-Aldrich, USA) 4.1.1 Použitý biologický materiál Buňky CHO-M1-M5 (cDNA resource Center USA) 4.2 Použité přístroje Automatické pipeta (BioHit Oyj, Finsko) Centrifuga Sigma 3K18 (Sigma Laborzenrifugen, Německo) Centrifuga Universal 16R (Hettich, Německo) 35 Čtecí přístroj pro radiometrickou a luminescenční detekci MicroBeta2 (Perkin Elmer, USA) Fluorescenční čtecí přístroj Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek Instruments, USA) Homogenizátor Ultra-Turrax (IKA, Německo) Inkubátor Sanyo CO2 incubator (Sanyo, Japonsko) Multikanálová pipeta (BioHit Oyj, Finsko) Spektrofotometr VICTOR multilabel plate reader (Perkin Elmer, USA) Vakuový filtrační přístroj Brandel Cell Harvester (Alpha Biotech, UK) Vyhřívaná třepačka na mikrotitrační destičky (Biosan, Litva) 4.3 Použité metody 4.3.1 Pěstování a sklízení buněk Buňky CHO (z angl. Chinese hamster ovary, vaječníky křečíka čínského), které stabilně exprimují jednotlivé podtypy muskarinových acetylcholinových receptorů M1-5 byly pěstovány v inkubátoru Sanyo CO2 inkubátor při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % CO2 v médiu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), které obsahovalo 10 % (v/v) fetálního hovězího séra a geneticin o koncentraci 50 µg/µl. Buňky byly nasazeny v množství 1 milion buněk na Petriho misku (o průměru 10 cm). Po 4 dnech růstu byl k buněčné kultuře přidán 5 mM butyrát sodný, který podporuje expresi muskarinových receptorů [119]. Po pěti dnech růstu byly buňky sklizeny jemnou trypsinizací. Adherované buňky na dně Petriho misky byly opláchnuty 10 ml fosfátového pufru pH = 7,4 (PBS, Phosphate Buffered Saline). Poté bylo k buňkám přidáno 4 ml PBS a 1 ml trypsinu o koncentraci 5 g/l. Po uvolnění byly buňky přeneseny do 50 ml centrifugační zkumavky od firmy Falcon. Zkumavky byly poté centrifugovány 3 minuty při 200× g při 4 °C. Po ukončení centrifugace byl odstraněn supernatant a pelety buněk byly uskladněny při teplotě -20 °C. 4.3.2 Příprava membrán Homogenizační médium: 20 mM Hepes; 100 mM NaCl; 10 mM EDTA; pH = 7,4 HMN pufr: 20 mM Hepes, 100 mM NaCl; 10 mM MgCl2; pH = 7,4 36 Do 50 ml centrifugační zkumavky obsahující buněčnou peletu (viz kapitola 4.3.1, strana 36), které byly inkubovány 30 min na ledu, bylo přidáno homogenizační médium (v poměru 1 ml na CHO buňky sklizené z jedné Petriho misky) a buňky byly resuspendovány pomocí pipety. Poté byly buňky homogenizovány pomocí homogenizátoru Turrax (IKA) při otáčkách 24 000 otáček za minutu dvakrát po dobu 30 sekund s 30 sekundovou prodlevou mezi homogenizacemi na ledu. Pomocí diferenční centrifugaci (1 000× g/5 min) proběhla sedimentace buněčných jader a celých buňek. Supernatant byl centrifugován při 30 000× g po dobu 30 minut. Po centrifugaci byl odstraněn supernatant odsátím a k peletě (membránová frakce) byl přidán 1 ml HMN pufru. Peleta ve zkumavce byla resuspendována pomocí pipety a inkubována 30 minut ve 4 °C. Po uplynutí doby byla provedena centrifugace 30 000× g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Supernatant byl opět odstraněn odsátím a získané membrány obsahující daný podtyp muskarinových receptorů byly uskladněny při teplotě -80 °C. 4.3.3 Příprava chinazolinových ligandů VN* Chinazolinové deriváty byly navrženy a připraveny prof. RNDr. Milanem Pourem, Ph.D. a PharmDr. Marcelem Špulákem, Ph.D. z oddělení Anorganické a Organické Chemie Farmaceutické Fakulty v Hradci Králové Univerzity Karlovy. Na základě bronchodilatačních účinků těchto derivátů pozorovaných ex-vivo na preparátu izolované průdušnice hlodavců byla kontaktována laboratoř neurochemie Fyziologického ústavu AV ČR, protože má dlouhodobou zkušenost s muskarinovými receptory, které mohou mít klíčovou roli v efektu bronchodilatace nových chinazolinových ligandů VN*. Syntéza těchto látek je uvedena v příloze (příloha 1). Látky VN015a a VN122c mají ve svojí struktuře síru, která způsobovala rozpad ligandu po delším čase. Látky VN014a a VN045b mají místo síry kyslík a k rozpadu u nich nedochází. Proto jsem se v této diplomové práci zaměřil na podrobnější analýzu (funkční pokusy, kinetické pokusy) látek VN014a a VN045b. 37 4.4 Biochemické experimenty 4.4.1 Stanovení koncentrace proteinů Roztok A: 5% SDS (v/v):CTC (10% (w/v) uhličitan sodný, 0,2% (w/v) vinan draselno-sodný, 0,1% (w/v) síran mědnatý):0,8 M NaOH:redestilovaná voda (2:1:1:4) Roztok B: Folinovo činidlo : redestilovaná voda (1 : 3) (v/v) Stanovení množství proteinu ve vzorku bylo provedeno spektrofotometricky Lowryho metodou [120] podle Petersonovy modifikace [121]. Jako standard pro tvorbu kalibrační řady byl použit hovězí sérový albumin (BSA) v rozsahu koncentrací 0-20 µg/vzorek. Stanovení proteinů bylo provedeno v 96-jamkových destičkách. Kalibrace a vzorky byly pipetovány v objemu 5 µl. Poté byl přidán roztok A v objemu 200 µl a po 10 minutách inkubace na vyhřívané třepačce mikrotitračních destiček Biosan (40 °C, 400 ot./min) byl přidán roztok B v objemu 50 µl. Po 30 minutách inkubace (40 °C, 400 ot./min) byla změřena absorbance při 690 nm na spektrofotometru VICTOR multilabel plate reader (Perkin Elmer). 4.4.2 Vazebné pokusy HMN pufr: 20 mM Hepes, 100 mM NaCl; 10 mM MgCl2; pH = 7,4 Vazebné pokusy byly provedeny v 96-jamkových destičkách v celkovém objemu 800 µl pro saturační pokusy a 400 µl pro kompetiční a kinetické pokusy. 4.4.2.1 Stanovení exprese muskarinových acetylcholinových receptorů Exprese jednotlivých podtypů muskarinových acetylcholinových receptorů (mAChR) byla stanovena pomocí saturačních pokusů s radioaktivně značeným neselektivním antagonistou muskarinových receptorů [3H]-N-methylskopolaminem. Získané membrány z kapitoly 4.3.2 byly rozpuštěny na koncentraci 25 µg proteinu na 1 ml HMN média. Do jednotlivých jamek 96-jamkové destičky bylo pipetováno 400 µl membránové suspenze (10 µg proteinu na jamku). Radioaktivně značený ligand [3H]-N-methylskopolamin byl o finální koncentraci 62,5-2000 pM přidán v celkovém objemu 400 µl. Stanovení bylo provedeno v kvadruplikátech. Nespecifická vazba NMS (N-methylskopolaminu) byla stanovena v přítomnosti 12,5 µM neznačeného 38 muskarinového antagonisty atropinu. Směs v jamkách byla inkubována při teplotě 25 °C na třepačce destiček po dobu tří (M1-M4 podtyp) nebo pěti hodin (M5 podtyp). Po inkubaci byl nenavázaný radioligand oddělen rychlou vakuovou filtrací (Brandel Cell Harvestor) pomocí filtračních destiček obsahující filtr se skleněným vláknem Whatman GF/C. Filtrační destička byla jednu hodinu před filtrací preinkubována s polyethyleniminem (PEI) pro snížení nespecifické vazby, a poté byla usušena v mikrovlnné troubě 2 min při 800 W. Do filtrační destičky bylo přidáno 40 µl scintilačního roztoku Rotiszint. Zachycená radioaktivita byla stanovena pomocí čtečky mikrodestiček pro radiometrickou detekci Microbeta2 Microplate Counter (Perkin Elmer). 4.4.2.2 Stanovení afinity chinazolinových ligandů k muskarinovým acetylcholinovým receptorům Afinita chinazolinových ligandů k mAChR byla stanovena pomocí kompetičního pokusu s radioaktivně značeným [3H]-NMS ([3H]-N-methylskopolamine) ve finální koncentraci 0,5 nM. Pro stanovení nespecifické vazby byl použit 1 mM atropin. Membrány CHO buněk exprimující jednotlivé podtypy mAChR byly inkubovány s 0,5 nM [3H]-NMS a vzrůstající koncentrací chinazolinových ligandů 10 nM až 1 mM po dobu 3 hodin (podtyp M1 – M4) nebo 5 hodin (podtyp M5). Po inkubaci byly membrány s navázaným radioligandem zfiltrovány vakuovou filtrací (Brandel cell harvester) pomocí filtrů Whatman GF/C preinkubované s polyethyleniminem (PEI) 1 hodinu před filtrací. Zachycená radioaktivita na filtru byla měřena pomocí přístroje MicroBeta2 Microplate Counter (Perkin Elmer). 4.4.2.3 Kinetické pokusy Látky, které se váží na receptor alostericky (do jiného než ortosterického vazebného místa), ovlivňují kinetiku vazby ortosterického ligandu. Efekt derivátů chinazolinu VN45b a VN14a na vazbu [3H]-NMS byl stanoven pomocí 2 druhů kinetických pokusů – měření asociace nebo disociace radioligandu. Kinetický pokus disociace Membrány CHO buněk exprimující daný podtyp muskarinových receptorů resuspendované v HMN pufru (10 µg proteinu na jamku) byly preinkubovány v přítomnosti radioligandu [3H]-NMS (finální koncentrace 1 nM) po dobu 3 (M1-M4) až 5 (M5) hodin při teplotě 25 °C na třepačce destiček při rychlosti 400 RPM. Poté byl 39 v časech 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 15; 20; 30; 60 a 90 minut před filtrací přidán buď samotný atropin o finální koncentraci 10 µM nebo atropin v kombinaci s testovaným ligandem o finální koncentraci odpovídající desetinásobku jeho afinity k příslušnému muskarinovému receptoru (KA, kapitola 5.2, tabulka 4, strana 49). Jednotlivé reaktanty byly rozpuštěny v HMN pufru. Inkubace byla ukončena rychlou vakuovou filtrací viz výše. Kinetický pokus asociace Membrány CHO buněk exprimující daný podtyp muskarinových receptorů resuspendované v HMN pufru (10 µg/jamku) byly preinkubovány v přítomnosti testovaného ligandu (o finální koncentraci odpovídající hodnotě jeho afinity k receptoru KA, kapitola 5.2, tabulka 4, strana 49) nebo pufru přes noc při teplotě 25 °C na třepačce destiček při rychlosti 400 RPM. Poté byl v časech 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 3; 5; 10; 15; 20 a 30 minut před filtrací přidán [3H]-NMS o finální koncentraci 2 nM. Inkubace byla ukončena rychlou vakuovou filtrací viz výše. 4.4.3 Receptorový systém M2+G15 a M4+G15 Prostřednictvím vnesení promiskuitního G-proteinu G15 do CHO buněk s expresí M2 a M4 muskarinových receptorů lze docílit napojení těchto podtypů muskarinových receptorů na signální dráhu Gq, která je preferenční signální drahou pro podtypy M1, M3 a M5. Toto uspořádání umožňuje sledovat aktivaci všech podtypů muskarinových receptorů prostřednictvím měření změny koncentrace vápenatých iontů v buňce. Koexprese muskarinových receptorů a promiskuitního G-proteinu G15 pro funkční analýzu byla popsána v řadě studií [24,122]. CHO buňky exprimující jednotlivě M2 a M4 receptory byly transfekovány plasmidem pCMV6-A-Hygro kódujícím alfa podjednotku G-proteinu G15 pomocí transfekčního činidla Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). Sub-konfluentní CHO M2 a M4 buňky byly inkubovány v médiu Optimem (Invitrogen, USA) (3 ml na 1 Petriho misku) obsahujícím plasmidovou DNA 1 µg/ml a transfekční činidlo Lipofectamine 2000 v koncentraci 5 µl/ml 6 hodin v inkubátoru při 37 °C v atmosféře obsahující 5 % CO2. Poté bylo médium odstraněno a přidáno růstové médium DMEM (10 ml na Petriho misku). Buňky byly sklizeny 48 hodin po transfekci jemnou trypsinizací (viz kapitola 4.3.1), naředěny v médiu DMEM obsahujícím selekční antibiotikum 40 hygromycin (200 µg/ml) a nasazeny na 96-jamkovou destičku o hustotě 5 buněk na jamku. Prostřednictvím hygromycinové rezistence byly selektovány klony, exprimující G15, α-podjednotku. Exprese G15 byla ověřena ve funkčním stanovení. 4.4.4 Stanovení koncentrace vápenatých iontů KHB (Krebs Hepes Buffer): 136 mM NaCl; 4 mM KCl; 1,2 mM MgCl2; 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM Na-HEPES; pH = 7,4 Reakční médium: 10 mM Glukosa; 1,3 mM CaCl2; 1 mM probenicid (rozpuštěný v 1M NaOH); v KHB; pH = 7,4 Nitrobuněčné koncentrace vápenatých iontů byla stanovena pomocí fluorescenční sondy FURA-2/AM (Fura-2-acetoxymethyl ester), která snadno proniká membránou a po odštěpení acetoxymethylové skupiny pomocí buněčné esterasy dochází k její aktivaci. Pro stabilizaci membrán, aby Fura-2 neunikala z buňky, se přidává při měření probenicid do KHB. Po vazbě vápenatých iontů dojde ke změně excitačního maxima fluorescenční sondy Fura-2 z 363 nm na 335 nm. V obou stavech je emisní maximum 510 nm. Buňky pro funkční stanovení vápenatých iontů byly rozsazeny na 96-jamkovou černou destičku pro měření fluorescence (Corning black flat bottom) v množství 10 až 15 tisíc buněk na jamku v objemu 100 μl na jamku. Po 2 dnech růstu bylo z destičky odebráno médium a buňky byly omyty reakčním médiem v objemu 200 μl na jamku. Buňky byly preinkubovány ve 100 μl reakčního média obsahující Fura-2/AM o koncentraci 10 μM a 0,1% Pluronic F68 (pro lepší průchodnost membránou) ve tmě přikryté hliníkovou fólií v inkubátoru 1 hodinu při 37 °C. Po inkubaci byla odstraněna reakční směs a destička opět omyta 200 μl/jamku reakčního média. Buňky byly inkubovány v přítomnosti chinazolinových derivátů v koncentracích od 3 μM do 1 mM v inkubátoru při 37 °C. Pomocí dispenzorů byl do jednotlivých jamek aplikován muskarinový agonista karbachol o koncentraci od 1 nM do 1 mM. Fluorescence byla měřena 3 s po aplikaci dle nastavení standardně vytvořené výrobcem. Pro měření fluorescence byl použit čtecí přístroj Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader (Biotek Instruments). Při pokusu byly pro excitaci použity vlnové délky 340 nm (vázáné Ca2+ ionty) a 380 nm (nenavázané Ca2+ ionty) pomocí monochromátoru Bandwith 10 nm. Poměr 41 hodnot 340/510 nm a 380/510 nm přímo odpovídá množství nitrobuněčné koncentraci vápenatých iontů [123]. 4.4.5 Stanovení vlivu nových chinazolinových ligandů na aktivitu acetylcholinesterasy Reakční médium: 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina (DTNB) 0,25 mM; Acetylthiocholin AcTCh 1 mM; Fosfátový pufr 100 mM pH = 7,4; Triton X-100 0,1% Stanovení acetylcholinesterasy bylo provedeno ve 4 nezávislých pokusech. Část mozkové kury myši byla homogenizována ve 100 mM fosfátovém pufru (1g/10ml) pomocí homogenizátoru Ultra-Turrax (IKA) dvakrát po dobu 30 sekund s 30-ti sekundovou prodlevou mezi jednotlivými kroky homogenizace. Homogenáty byly centrifugovány (5 minut při 1 000× g a teplotě 4 °C). Získaný supernatant byl přenesen do 2 ml zkumavek od firmy Eppendorf. Bylo stanoveno množství proteinů podle Petersonovy modifikace Lowryho metody (viz kapitola 4.4.1 – Stanovení koncentrace proteinů). Jednotlivé homogenáty byly ředěny pomocí 100 mM fosfátového pufru na výslednou koncentraci 0,5 µg/µl proteinu. Na 96 jamkovou destičku bylo pipetováno 20 µl homogenátu tedy 10 µg, jako slepý vzorek byl použit samotný fosfátový pufr. K homogenátu (krom kontroly (eserin) a slepému vzorku) byly pipetovány 2 µl chinazolinového ligandu VN45b o finální koncentraci 0,1; 1; 10 a 100 µM. Pro ověření funkčnosti experimentu byla stanovována aktivita samotného enzymu acetylcholinesterasy (AChE), který byl přidán místo tkáňového homogenátu v množství 10 mU/µl. Dále byl v pokusu použit eserin o 20 µM koncentraci, což je silný specifický inhibitor AChE a jeho role v tomto experimentu je pozitivní kontrola inhibičního účinku. Reakce byla startována přidáním směsi reakčního média do 96 jamkové destičky a následným opakovaným měřením (počet měření = 14 × po 5 minutách) absorbance při 405 nm na spektrofotometru VICTOR multilabel plate reader (Perkin Elmer). Od výsledných dat byl odečten čas 0 a slepý vzorek. 4.4.6 Vyhodnocování dat Veškerá data byla zpracována nejprve v tabulkovém editoru LibreOffice Calc. Dále byly použity programy GraceGTK 1.0.2, GraphPad Prism 9 a modul matplotlib pro programovací jazyk Python3 pro vytvoření grafů. 42 V saturačních pokusech byla vynesena hodnota vazby radioligandu 3H-N-methylskopolaminu (osa Y) v závislosti na koncentraci tohoto radioligandu (osa X) podle rovnice 1. B y= max×x (rovnice 1) x+K D Bmax je maximální vazebná kapacita a KD je rovnovážná disociační konstanta, která odpovídá koncentraci radioligandu s 50% obsazeností vazebných míst a dále popisuje afinitu radioligandu [3H]-NMS k danému muskarinovému receptoru. Pro vypočtení afinity daného chinazolinového ligandu k muskarinovému receptoru byl použit kompetiční pokus, kdy chinazolinový ligand kompetuje o vazebné místo s radioaktivně značeným ligandem [3H]-NMS. Rovnovážná disociační konstanta alosterického modulátoru KA v rovnovážném vazebném pokusu s [3H]-NMS byla získána proložením rovnice 2. [D ]+K y = D (rovnice 2) K +x [D ]+K A D x K A+α kde y určuje vazbu radioligandu v závislosti na koncentraci alosterického modulátoru x. Vazba radioligandu je vyjádřená jako frakce vazby v nepřítomnosti alosterického modulátoru (kontroly), [D] je koncentrace radioligandu [3H]-NMS, α je faktor vazebné kooperativity mezi alosterickým modulátorem a radioligandem [124] a KD je disociační konstanta radioligandu, která byla získána pomocí rovnice (1) z výsledků saturačního pokusu. Rovnovážnou disociační konstantu inhibitoru lze získat z rovnovážného vazebného pokusu s [3H]-NMS proložením rovnice 3. IC K 50 i= (rovnice 3) + [D ] 1 K D kde [D] je koncentrace [3H]-NMS a KD je disociační konstanta, která byla získána z rovnice (1) k výsledkům saturačního pokusu. Hodnota IC50 (koncentrace antagonisty vytěsňující 50 % radioligandu [3H]-NMS) byla vypočtena z rovnice 4. y=100−100×x (rovnice 4) x+ IC50 43 kdy y určuje vazbu radioligandu při koncentraci antagonisty x v procentech vazby bez antagonisty (kontroly). Pro ověření alosterického módu interakce byla nejprve měřena rychlost disociace radioligandu [3H]-NMS v přítomnosti a nepřítomnosti chinazolinového ligandu, kdy získaná data byla zpracována podle rovnice 5. y=100×e−k off×x (rovnice 5) kdy y určuje vazbu radioligandu [3H]-NMS v čase x vyjádřenou v procentech vazby na začátku disociace. koff značí disociační rychlostní konstantu. Data získaná z kinetického pokusu asociace radioligandu [3H]-NMS s muskarinovým receptorem v přítomnosti nebo nepřítomnosti chinazolinového ligandu, byla proložena křivkou podle rovnice 6. y=B ×(1−e−kon×x eq ) (rovnice 6) kdy y určuje vazbu radioligandu [3H]-NMS v daném čase x. Beq značí vazbu radioligandu v rovnováze a kon značí asociační rychlostní konstantu. Ve funkčních pokusech (měření vápenatých iontů pomocí fluorescenční sondy FURA-2/AM) byla měřena biologická odpověď vyvolaná danou koncentrací agonisty, v tomto případě pomocí agonisty karbacholu (CBC). Získaná data byla zpracována, vynesena do grafu a proložena rovnicí 7. (E nH y=1+ max−1)×x ( xnH+ECnH (rovnice 7) 50 ) kdy y značí funkční odpověd receptoru vyvolanou určitou koncentrací agonisty x, vyjádřenou jako násobek hladiny vápenatých iontů v nepřítomnosti agonisty. Emax vyjadřuje maximální funkční odpověď, která odpovídá schopnosti agonisty vyvolat biologický účinek. nH značí Hillův koeficient, který popisuje sklon křivky funkční odpovědi. Člen EC50 vyjadřuje koncentraci agonisty, kdy došlo k vyvolání poloviny maximální odpovědi a zároveň také vyjadřuje, jakou má daný ligand potenci vyvolat biologický účinek. Pro určení míry antagonismu daného chinazolinového ligandu byla použita Schildova analýza. Při kompetici mezi agonistou a antagonistou, je blokování funkční odpovědi agonisty antagonistou překonatelné vyšší koncentrací agonisty. To vede k tomu, že v přítomnosti antagonisty je pro vyvolání stejné odpovědi potřeba vyšší koncentrace agonisty. Dochází k posunu křivky funkční odpovědi (rovnice 5) k vyšším hodnotám EC50. Vztah mezi poměrem EC50 v přítomnosti a nepřítomnosti antagonisty 44 (DR, z angl. dose-ratios), jeho koncentrací [B] a rovnovážnou disociační konstantou KB [125] je dán rovnicí 8. log(DR−1)= log [B ]− log (KB) (rovnice 8) V případě kompetitivní interakce KB je rovna Ki určené ve vazebném pokusu (rovnice 3). V případě alosterické intreakce mezi agonistou a alosterickým modulátorem též dochází k posunu křivky funkční odpovědi. Velikost tohoto posunu je však omezena faktorem kooperativity α. Vztah mezi posunem DR, koncentrací alosterického antagonisty [B] a jeho rovnovážné disociační konstanty KB je dán rovnicí 9. 1−γ log(DR−1) = log [B] (rovnice 9) γ[B]+KB Hodnota faktoru kooperativity γ se může lišit od hodnoty α určené v rovnovážném vazebném pokusu (rovnice 2), protože alosterický modulátor může kromě afinity ovlivňovat i účinnost agonisty [126]. Pokud se hodnota γ nerovná hodnotě α, pak ani hodnota KB se nerovná KA. 45 5 Výsledky 5.1 Exprese a vazebné vlastnosti jednotlivých podtypů muskarinových acetylcholinových receptorů v membránách CHO buněk Pro zjištění míry exprese a afinity jednotlivých podtypů muskarinových receptorů M1-5 byla stanovena vazba radioaktivně značeného [3H]-N-methylskopolaminem ([3H]-NMS) na buněčné membrány s jednotlivými exprimovanými receptory. Hodnoty disociačních konstant (KD), vyjadřující afinitu [3H]-NMS k receptoru, a Bmax vyjadřující míru exprese, byly určeny z vazebných křivek (obrázky 12 a 13, strana 46 a 47) podle rovnice 1, strana 43 a jsou uvedeny v tabulce 3, strana 47, kdy míra exprese receptorů se pohybuje v rozmezí od nejmenší hodnoty 1,4 pmol/mg membránového proteinu pro receptor M5 až po 17,34 pmol/mg proteinu pro M2 receptor. Míra afinity [3H]-NMS vyjádřená pomocí disociačních konstant KD se pohybovala v rozmezí 76,4 pM pro M4 až 399,8 pM pro M2 receptor. Hodnoty disociačních konstant KD byly využity pro výpočet afinity (disociačních konstant KA) chinazolinových ligandů na receptor v kompetičních pokusech s radioligandem [3H]-NMS. Obrázek 12: Vazba radioligandu [3H]-N-methylskopolaminu na membrány CHO buněk, které exprimují muskarinové receptory M . Vazba [3 1-4 H]-NMS na membrány, udávající množství receptorů je vyjádřena v pmol/mg membránových proteinů (osa y) oproti rostoucí koncentraci přidaného radioligandu (osa x). Disociační konstanty KD byly získány proložením křivek podle rovnice 1, strana 43. 46 Obrázek 13: Vazba radioligandu [3H]-N-methylskopolaminu na membrány CHO buněk, které exprimují muskarinové receptory M5. Vazba [3H]-NMS na membrány, udávající množství receptorů (osa y) je vyjádřena v pmol/mg membránových proteinů oproti rostoucí koncentraci přidaného radioligandu (osa x). Disociační konstanta KD byla získána po proložením křivky podle rovnice 1, strana 43. Tabulka 3: Exprese a afinita [3H]-NMS k muskarinovým receptorům M1-M5 exprimovaným v membránách CHO buněk. Disociační konstanta KD v pM koncentraci vyjadřuje afinitu [3H]-NMS k muskarinovým receptorům. Maximální vazba B 3 max [ H]-NMS v pmol/mg membránových proteinů vyjadřuje míru exprese muskarinových receptorů. KD [pM] Bmax [pmol/mg] M1 111,89 ± 9,46 5,59 ± 0,12 M2 399,80 ± 29,98 17,34 ± 0,47 M3 92,39 ± 8,90 8,03 ± 0,19 M4 76,40 ± 5,48 9,40 ± 0,15 M5 145,98 ± 10,37 1,40 ± 0,03 5.2 Afinita testovaných chinazolinových derivátů k muskarinovým receptorům Afinita 4 nových chinazolinových derivátů k pěti podtypům muskarinových receptorů M1 až M5 byla stanovena ve vazebných kompetičních pokusech s radioligandem [3H]-NMS. Hodnoty IC50 chinazolinových derivátů, které vyjadřují koncentraci testovaného derivátu chinazolinu, která vytěsní z 50 % vazbu radioligandu 47 [3H]-NMS, byly získány z inhibičních (kompetičních) křivek s [3H]-NMS (obrázek 14) proložených podle rovnice 2. Hodnoty IC50 byly využity pro výpočet afinity testovaného derivátu chinazolinu k příslušnému receptoru. Afinity derivátů chinazolinu vyjádřené pomocí disociační konstanty alosterického modulátoru KA byly vypočteny podle rovnice 2, str. 44. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4 jako hodnoty disociačních konstant alosterického modulátoru KA v µM koncentraci. Nejvyšší afinitu měla látka VN122c k M4 receptoru (KA = 0,28 µM), naopak nejnižší afinitu k receptoru měla látka VN14a na M5 receptoru (KA = 236,53 µM). Z kompetičních křivek chinazolinových derivátů s [3H]-NMS (obrázek 14) lze pozorovat, že nedochází k úplnému vytěsnění radioligandu [3H]-NMS. To naznačuje, že chinazolinové deriváty nekompetují o vazebné místo NMS, ale dochází k jejich vazbě do jiného, alosterického místa. Pro ověření této hypotézy byly dále provedeny kinetické pokusy vazby (viz kapitola 4.4.2.3). Obrázek 14: Kompetice radioligandu [3H]-NMS s chinazolinovými deriváty VN14a (A), VN15a (B), VN45b (C), VN122c (D) na muskarinových receptorech M1-M5. Vazba 0,5 nM [3H]-NMS na muskarinové receptory (osa y, je vyjádřena jako procenta kontroly v nepřítomnosti testovaného ligandu) v závislosti na vzrůstající koncentraci 4 testovaných derivátů chinazolinu (osa x, vyjádřená jako log jejich koncentrace). Afinity chinazolinových derivátů pro jednotlivé podtypy muskarinových receptorů, vypočtené z rovnice 2, jsou shrnuty v tabulce 4. Jednotlivé body označují průměr hodnot ze 4 nezávislých pokusů v kvadruplikátech spolu se směrodatnou odchylkou. 48 Tabulka 4: Afinita chinazolinových derivátů k muskarinovým receptorům M1-M5. Afinity 4 chinazolinových ligandů (VN014a, VN015a, VN045b, VN122c), měřené pomocí kompetice s radioligandem [3H]-NMS, jsou vyjádřeny jako rovnovážná disociační konstanta (KA) v µM. Data byla získána ze tří až čtyř nezávislých pokusů v kvadruplikátech a jsou uvedena jako průměr ± směrodatná odchylka. KA [µM] Podtyp M1 M2 M3 M Derivát 4 M5 VN14a 34,89 ± 7,43 33,69 ± 7,73 25,11 ± 2,4 30,68 ± 2,56 236,53 ± 26,06 VN15a 2,74 ± 0,4 1,01 ± 0,27 1,37 ± 0,28 0,9 ± 0,19 7,7 ± 0,51 VN45b 7,23 ± 1,24 1,56 ± 0,1 1,98 ± 0,13 3,22 ± 0,88 19,55 ± 6,51 VN122c 1,91 ± 1,09 0,59 ± 0,24 0,87 ± 0,47 0,28 ± 0,08 6,29 ± 1,41 5.3 Měření hladiny vápenatých iontů v buňkách pomocí fluorescenčně značené sondy FURA-2/AM v přítomnosti látek VN14a a VN45b Chinazolinové deriváty VN15a a VN122c mají ve své struktuře síru, která byla nejspíše hlavním důvodem degradace rozpuštěného vzorku po několika dnech. V případě chinazolinového derivátu VN122c bylo navíc obtížnější derivát rozpustit při přípravě zásobního roztoku. Látky VN14a a VN45b mají místo síry kyslík a žádný z výše popsaných problému se u nich neobjevil. Po konzultaci s pracovníky z laboratoře v Hradci Králové bylo rozhodnuto provést funkční a kinetické pokusy pouze na látkách VN14a a VN45b. Vliv chinazolinových derivátů VN14a a VN45b na karbacholem stimulovanou aktivaci muskarinových receptorů byl určen prostřednictvím stanovení cytosolární koncentrace Ca2+ s využitím fluorescenčně značené sondy FURA-2/AM při excitačních vlnových délkách 340 a 380 nm a při emisní vlnové délce 510 nm. Aktivací muskarinových receptorů M1, M3 a M5 (u receptorů M2 a M4 v přítomnosti G-proteinu G15) dojde k uvolnění vápenatých iontů z endoplasmatického retikula. Zvýšení nitrobuněčné koncentrace vápenatých iontů je úměrné míře aktivace receptoru. Poměr intenzit fluorescence čtené při 510 nm při excitaci 340 nm (excitační maximum s navázaným vápenatým iontem na fluorescenční sondu Fura-2) a 380 nm (excitační 49 maximum volné fluorescenční sondy Fura-2) je přímo úměrný koncentraci vápenatých iontů. Pro určení míry antagonismu bylo zkoumáno, jak chinazolinové ligandy ovlivňují aktivaci receptoru karbacholem, který je plným neselektivním agonistou muskarinových receptorů. Grafy (obrázek 15 A-E) ukazují funkční odpověď agonisty karbacholu (černá, struktura obrázek 15 F) v přítomnosti derivátů chinazolinu VN45b (modrá) a VN14a (červená) v koncentračním rozsahu od 3 µM do 1 mM (světlejší barva odpovídá vyšší koncentraci chinazolinových ligandů). Obrázek 15: Vliv nových chinazolinových derivátů (VN14a, VN45b) na karbacholem stimulované zvýšení hladiny vápenatých iontů v CHO buňkách exprimujících jednotlivé podtypy receptorů M1-5 (A-E). Struktura karbacholu (F). Hladina vápenatých iontů (osa y, vyjádřena jako % odpovědi agonisty karbacholu) v závislosti na koncentraci agonisty karbacholu (osa x, vyjádřena jako log koncentrace). Černá křivka označuje kontrolní křivku karbacholu v nepřítomnosti chinazolinových derivátů. Modré křivky označují látku VN45b, červené křivky označují látku VN14a, zvyšující se koncentrace chinazolinových derivátů od 3 µM do 1 mM je označena snižující se sytostí křivek příslušného chinazolinového derivátu. Body jsou průměr ± směrodatná odchylka ze tří až čtyř nezávislých pokusů v kvadruplikátech. 50 Tabulka 5: Hodnoty efektivních koncentrací agonisty karbacholu, vyvolávající polovinu maximální odpovědi, vyjádřené jako záporný dekadický logaritmus EC50 (pEC50) při koncentracích derivátu chinazolinu VN45b vyjádřených jako dekadický logaritmus koncentrací (log c). Hodnoty byly získány proložením funkčních odpovědí karbacholu v přítomnosti zvyšujících se koncentrací chinazolinových derivátů rovnicí 7 strana 44, obrázek 15 strana 50 a získané hodnoty pEC50 jsou uvedeny v tabulce jako průměr ± směrodatná odchylka ze tří až čtyř nezávislých pokusů v kvadruplikátech. VN45b pEC50 karbacholu vyvolávající uvolnění Ca2+ iontů VN [log c] M1 M2 M3 M4 M5 0 7,21 ± 0,18 5,96 ± 0,20 7,36 ± 0,05 5,71 ± 0,15 6,04 ± 0,00 -6 6,98 ± 0,23 5,50 ± 0,22 7,03 ± 0,06 5,27 ± 0,07 - -5,5 6,82 ± 0,15 5,10 ± 0,15 6,78 ± 0,19 4,82 ± 0,09 - -5 6,43 ± 0,27 4,68 ± 0,03 6,35 ± 0,04 4,57 ± 0,13 - -4,5 6,14 ± 0,18 4,50 ± 0,00 5,91 ± 0,20 4,53 ± 0,05 5,90 ± 0,00 -4 5,60 ± 0,27 4,50 ± 0,00 5,28 ± 0,20 4,50 ± 0,00 5,56 ± 0,06 -3,5 - - - - 5,22 ± 0,01 -3 - - - - 4,80 ± 0,02 Tabulka 6: Hodnoty efektivních koncentrací agonisty karbacholu, vyvolávající polovinu maximální odpovědi, vyjádřené jako záporný dekadický logaritmus EC50 (pEC50) při koncentracích derivátu chinazolinu VN14a vyjádřených jako dekadický logaritmus koncentrací (log c). Hodnoty byly získány proložením funkčních odpovědí karbacholu v přítomnosti zvyšujících se koncentrací chinazolinových derivátů rovnicí 7 strana 44, obrázek 15 strana 50 a získané hodnoty pEC50 jsou uvedeny v tabulce jako průměr ± směrodatná odchylka ze tří až čtyř nezávislých pokusů v kvadruplikátech. VN14a pEC50 karbacholu vyvolávající uvolnění Ca2+ iontů VN [log c] M1 M2 M3 M4 M5 0 7,56 ± 0,16 5,92 ± 0,36 7,70 ± 0,15 5,71 ± 0,15 6,03 ± 0,02 -4,5 7,16 ± 0,09 5,54 ± 0,29 7,28 ± 0,04 5,25 ± 0,09 - -4 6,82 ± 0,17 5,24 ± 0,35 6,77 ± 0,05 4,91 ± 0,09 - -3,5 6,25 ± 0,04 4,79 ± 0,16 6,21 ± 0,17 4,46 ± 0,12 5,70 ± 0,06 -3 5,78 ± 0,03 4,50 ± 0,00 5,56 ± 0,38 4,05 ± 0,08 5,35 ± 0,04 Hodnoty pEC50 byly dále použity pro výpočet členu DR (z angl. dose-ratios) pro Schildovu analýzu k výpočtu rovnovážných disociačních konstant KB udávajících míru antagonismu chinazolinových derivátů. Člen DR byl vypočten z poměru hodnot EC50 51 získaných z měření funkční odpovědi receptoru na agonistu karbacholu v přítomnosti a nepřítomnosti chinazolinového ligandu (viz analýza dat, kapitola 4.4.6, strana 42). Schildovou analýzou (kapitola 4.4.6, strana 42) byly podle rovnice 9, strana 45 vypočteny hodnoty konstant KB. Obrázek 16: Schildova analýza funkčního antagnonismu na muskarinových podtypech M1 až M5 (A-E). Logaritmus poměru ekviefektivních koncentrací EC50 karbacholu (osa y, hodnota DR (z angl. dose-ratios) v přítomnosti chinazolinových derivátů VN45b (modrá křivka) nebo VN14a (červená křivka)) vypočtené z tabulek 5-6 v závislosti na jejich koncentraci (osa x, vyjádřených jako logaritmus koncentrace). Body jsou průměr ± směrodatná odchylka z tří až čtyř nezávislých pokusů v kvadruplikátech. Data byla proložena rovnicemi 8 a 9 (VN45b na M2 a M4 receptoru), strana 45 a byly získány hodnoty KB, převedené na dekadický logaritmus hodnot KB (pKB), které jsou uvedeny v grafech a shrnuty v tabulce 7. Konstanty KB byly převedeny na záporný dekadický logaritmus hodnoty KB (pKB) a jejich hodnoty pro ligandy VN45b a VN14a jsou uvedeny v tabulce 7. Tabulka 7: Hodnoty disociačních konstant KB uvedené jako záporný logaritmus pKB. Hodnoty byly získané pomocí Schildovy analýzy (Obrázek 16) podle rovnice 8 a 9 (strana 45). pKB (VN45b) pKB (VN14a) M1 5,68 ± 0,05 4,80 ± 0,1 M2 6,40 ± 0,02 4,61 ± 0,25 M3 5,99 ± 0,06 4,91 ± 0,06 M4 6,41 ± 0,21 4,71 ± 0,09 M5 4,22 ± 0,04 3,56 ± 0,07 52 Zaoblení křivky (saturace antagonismu, obrázek 16, strana 52) u muskarinového podtypu M2 a M4 indikuje alosterický způsob vazby chinazolinových derivátů. Látka VN14a má na muskarinových receptorech M2 a M3 hodnoty KB přibližně v řádu 10 µM, kdežto látka VN45b má hodnoty KB přibližně 1 µM. Látka VN45b je tedy přibližně 10× účinnější než látka VN14a v inhibici muskarinových receptorů M2 a M3, které zprostředkovávají kontrakci hladké svaloviny při mnoha onemocněních dýchacích cest jako je astma a chronická obstrukční plicní nemoc. U látky VN45b je v grafech Schildovy analýzy (obrázek 16, strana 52) pro muskarinový podtyp M2 a M4 pozorovatelné zaoblení křivky (saturace antagonismu). Tento jev indikuje také alosterický mód interakce a dá se očekávat, že při vyšších koncentracích ligandu by se alosterický efekt touto metodou projevil i u ostatních podtypů muskarinových receptorů [125]. 5.4 Kinetické pokusy u látek VN14a a VN45b Kompetiční vazebné pokusy ukazují, že nedochází k úplné inhibici, tedy k úplnému vytěsnění vazby radioligandu [3H]-N-methylskopolaminu na receptor. Důvodem může být alosterický mód interakce, tedy případ, kdy se ligand neváže do ortosterického místa, ale do alosterického a nekompetuje tak s [3H]-NMS o vazebné místo na receptoru [127], ale alostericky ovlivňuje afinitu ortosterického ligandu k receptoru. Tato interakce způsobí stabilizaci alternativní konformace receptoru, která se liší v rychlosti asociace nebo disociace ortosterického ligandu [128]. Pro stanovení vlivu látek VN45b a VN14a na kinetiku vazby radioligandu [3H]-NMS bylo provedeno měření asociace (při testované koncentraci 2 nM) nebo disociace (při testované koncentraci 1 nM) radioligandu [3H]-NMS v přítomnosti těchto testovaných látek. V přítomnosti desetinásobku afinity VN14a (10× KA) k jednotlivým muskarinovým podtypům: 0,38 mM (M1); 0,34 mM (M2); 0,25 mM (M3); 0,31 mM (M4) a 2,36 mM (M5) bylo prokázáno zpomalení disociace [3H]-NMS u všech podtypů muskarinových receptorů. Vliv 19,8 µM VN45b (10× KA) na rychlost disociace [3H]-NMS na podtypu M3 nebyl patrný. Vliv látky VN45b na kinetiku vazby [3H]-NMS byl tedy stanoven měřením rychlosti asociace [3H]-NMS. Výsledky naznačují, že VN45b zpomaluje asociaci [3H]-NMS u všech podtypů muskarinových receptorů. 53 Obrázek 17: Asociace a disociace radioligandu [3H]-N-methylskopolaminu ([3H]-NMS) v přítomnosti derivátů chinazolinu VN14a a VN45b. Vazba radioligandu [3H]-NMS o koncentraci 1 nM (v případě disociace) a 2 nM (v případě asociace) na muskarinové receptory M1-M5 (osa y, vyjádřena jako procenta radioligandu [3H]-NMS v rovnováze) v závislosti na čase (osa x, v minutách). V grafech je patrné zpomalení vazby radioligandu [3H]-NMS v přítomnosti látky VN14a (červená křivka) nebo VN45b (modrá křivka) oproti kontrole bez chinazolinových derivátů (černá křivka). Data byla získána ze tří nezávislých pokusů disociace nebo asociace. Chybové úsečky vyjadřují rozptyl hodnot průměrů získaných z kvadruplikátů. Křivky byly získány proložením získaných dat pomocí rovnic 5 a 6, str. 45. Výsledky v mé diplomové práci ukazují, že deriváty chinazolinu VN14a a VN45b alostericky ovlivňují vazbu [3H]-N-methylskopolaminu ([3H]-NMS). To potvrzuje i podtypová selektivita, která je pro alosterické modulátory typická. 5.5 Vliv ligandu VN45b na acetylcholinesterasu Kvůli strukturní podobnosti nových chinazolinových derivátů s takrinem, což je silný inhibitor acetylcholinesterasy, bylo provedeno stanovení aktivity AChE v přítomnosti chinazolinového derivátu VN45b. Z výsledků, které jsou uvedené v grafu (obrázek 18) – je patrné, že při nejvyšší koncentraci (100 µM) dochází k inhibici cca 25% aktivity. Jedná se ale o stonásobně vyšší koncentraci než je afinita chinazolinového ligandu VN45b k muskarinovému receptoru M2 a M3 (KA (M2) = 1,56 ± 0,1 µM; KA (M3) = 1,98 ± 0,13 µM). Při koncentraci 1 µM k inhibici nedochází, lze tedy potvrdit, že látka VN45b při koncentraci odpovídající KA nemá vliv na AChE. Vliv na aktivitu AChE má až 100 µM koncentace VN45b. 54 Obrázek 18: Stanovení aktivity acetylcholinesterasy v přítomnosti zvyšující se koncentrace VN45b. Aktivita AChE s chinazolinovým derivátem VN45b o finální koncentraci 0,1 až 100 µM a 20 µM eserinem (silný inhibitor acetylcholinesterasy) je vyjádřena jako rozdíl absorbance po 15-ti minutách reakce při vlnové délce λ = 405 nm. ** označuje signifikantní snížení aktivity AChE p < 0,05. Data byla získána ze 4 až 5 nezávislých pokusů po odečtení hodnot naměřených na začátku reakce. 55 6 Diskuze Astma a chronická obstrukční plicní nemoc jsou dvě závažná plicní onemocnění, která se projevují zánětem a neprůchodností dýchacích cest, jež postihují miliony lidí po celém světe [5]. V současné době je způsobem léčby kombinace tří látek. Inhalované kortikosteroidy (ICS) potlačující zánět dýchacích cest, dlouhodobě působící agonisté β2-adrenergních receptorů (LABA) a dlouhodobě působící antagonisté muskarinových receptorů (LAMA – příklad tiotropium) způsobující relaxaci hladkého svalstva [95]. Muskarinové receptory M2 a M3 hrají klíčovou roli při kontrakci hladké svaloviny. V dýchacích cestách a plicích jejich nadměrná aktivace vede k astmatu nebo chronické obstrukční plicní nemoci [4]. Relaxace hladké svaloviny vyvolaná muskarinovými antagonisty představuje terapeutický nástroj při léčbě těchto onemocnění. Tento efekt byl již pozorován u tiotropia, který ale díky své nedostatečné podtypové selektivitě vykazuje nežádoucí vedlejší účinky jako například sucho v ústech, bolest v krku nebo zvýšenou tepovou frekvenci. Díky vysoké podobnosti ortosterického vazebného místa u všech podtypů muskarinových receptorů je obtížné najít ligandy, které se liší v afinitě k jednotlivým podtypům muskarinových receptorů. Látky, které se váží do méně konzervovaných alosterických oblastí receptoru mohou splňovat podmínky dostatečné vazebné selektivity mezi podtypy. Některé látky mohou selektivně modulovat muskarinové receptory díky různé době působení na jednotlivých podtypech receptorů. Díky možnému inhalačnímu způsobu podání je možné omezit systémové vedlejší účinky a lokalizovat místo účinku. Záleží zde na chemické struktuře látek, která následně rozhoduje o jejich absorpci a distribuci v organismu. Muskarinoví antagonisté cíleně působící na hladké svalstvo často obsahují ve své struktuře kvartérní dusík, a proto nedochází k přechodu látky přes hematoencefalitickou bariéru a v případě, že se vyskytnou nežádoucí účinky, jedná se pouze o ty vyvolané na periferii (např. sucho v ústech, rozostřené vidění, zvýšená tepová frekvence). Nalezení podtypově selektivních antagonistů muskarinových receptorů M2 a M3 může vést k účinnější a bezpečnější léčbě výše zmíněných nemocí [93]. Vasicininon a vasicin (viz obrázek 9, strana 32) jsou přírodní alkaloidy z hluchavkovité rostliny Adatoda léčivá (Justicia adhatoda) [114]. Tato rostlina byla historicky používána při léčbě respiračních onemocnění a problémech s dýcháním. 56 Přírodní látky jsou sice cenný zdroj možných nových účinných látek, ale dost často mají problematické vlastnosti jako špatnou rozpustnost nebo špatné farmakokinetické parametry, které omezují jejich použití. Proto možnou cestou zlepšení vlastností přírodních alkaloidů je jejich modifikace. Strukturní modifikací těchto dvou alkaloidů bylo zjištěno, že C kruh (viz obrázek 9, strana 32) není pro jejich bronchodilatační aktivitu důležitý a je možné jej odstranit, čímž je získána struktura chinazolinu, jejíž modifikace může vést k účinnějším derivátům s lepšími vlastnostmi [7]. Deriváty chinazolinu jsou již delší dobu zkoumány pro své bronchodilatační účinky [117,118]. Dva deriváty použité v této diplomové práci (VN14a a VN15a) byly již podrobeny analýze účinku na izolované průdušnici hlodavců, morčete a potkana. Izolovaná tkáň byla preinkubována s chinazolinovými deriváty nebo ipratropiem (muskarinový antagonista, obrázek 5, strana 29), a poté byl postupně přidáván karbachol, agonista muskarinových receptorů, který vyvolává kontrakci hladkého svalstva přes muskarinové receptory M2 a M3. U tkáně preinkubované s chinazolinovými deriváty nebo ipratropiem nedošlo k tak silné kontrakci, což naznačovalo možné působení nových chinazolinových derivátů přes muskarinové receptory [7]. V této diplomové práci jsem se zabýval farmakologickou analýzou 4 derivátů chinazolinu (VN14a a VN15a – publikované ve Špulák a spol. 2014 [7], VN45b a VN122c – nově syntetizované deriváty, obsahující nově atom bromu v pozici C7 chinazolinu – viz struktury obrázek 11, strana 33). Cílem diplomové práce bylo zjistit, zda bronchodilatační efekt chinazolinových derivátů je způsobený vazbou na muskarinové receptory, což naznačovala předběžná data, a jakým mechanismem interagují tyto deriváty s muskarinovými receptory. Pro farmakologickou analýzu byly použity buňky z vaječníků křečíka čínského (Cricetulus griseus) (CHO, z angl. chinese hamster ovary), které stabilně exprimují jednotlivé podtypy muskarinových receptorů M1 až M5. Pro zjištění afinity chinazolinových derivátů k muskarinovým receptorům byl využit radioligand [3H]-N-methylskopolamin ([3H]-NMS), který se váže do ortosterického vazebného místa všech muskarinových podtypů. Prostřednictvím kompetičních vazebných pokusů jsem sledoval, jak chinazolinové deriváty kompetují s [3H]-NMS o ortosterické vazebné místo. Bylo zjištěno, že látky jsou schopné vazby ke všem podtypům muskarinových 57 receptorů. Největší afinita byla zjištěna u muskarinových receptorů M2, M3 a M4, ale nedochází k výrazné vazebné podtypové selektivitě (viz tabulka 4, strana 49). V kompetičních pokusech s chinazolinovými deriváty nedošlo ani při vysokých koncentracích k plnému vytěsnění [3H]-NMS z vazebného místa (viz graf kompetičního pokusu - obrázek 14, strana 48), což naznačovalo, že se chinazolinové deriváty váží do alosterického místa, tedy jinam než [3H]-NMS, který se váže do ortosterického místa, a jsou schopné alostericky ovlivnit jeho afinitu k receptoru. Dva z testovaných derivátů chinazolinu (viz obrázek 11, strana 33) obsahují ve své struktuře atom síry (VN15a a VN122c), a pravděpodobně jsou nestabilní v roztoku. Látka VN122c je navíc málo rozpustná ve vodných roztocích. Látky VN45b a VN14a obsahují místo atomu síry atom kyslíku jsou stabilní a dobře rozpustné. Proto byly funkční pokusy a kinetické pokusy (asociace a disociace – pro potvrzení alosterického módu interakce) provedeny pouze u těchto látek (VN14a a VN45b). Na rozdíl od kompetice, pro případ alosterické interakce mezi ligandy může dojít ke změně kinetiky vazby. Změna kinetiky vazby ligandu v přítomnosti jiného ligandu je tedy ukazatelem alosterické interakce mezi nimi. Pro potvrzení alosterického módu interakce chinazolinových derivátů s muskarinovými receptory byly provedeny kinetické vazebné pokusy (vliv na disociaci a asociaci [3H]-NMS), které prokázaly alosterický mód jejich interakce. Nejprve byla měřena disociace ortosterického ligandu [3H]-N-methylskopolaminu v přítomnosti a absenci látek VN45b a VN14a. U látky VN45b se rychlost disociace [3H]-NMS neměnila (viz graf obrázek 17, strana 54). Důvodem může být příliš pomalá asociace chinazolinového derivátu VN45b oproti atropinu (který byl použit ve vysoké koncentraci pro vyvolání disociace [3H]-NMS) z receptoru. Z tohoto důvodu byla měřena asociace [3H]-NMS v přítomnosti a absenci látky VN45b, kdy došlo vlivem VN45b k výraznému zpomalení asociace [3H]-NMS. Z tohoto důvodu byly měřeny pokusy disociace [3H]-NMS v přítomnosti VN14a a asociace [3H]-NMS v přítomnosti VN45b. Pro měření funkční odpovědi byly opět použity buňky CHO exprimující jednotlivé muskarinové podtypy. Funkční odpověď receptoru byla stanovována jako karbacholem vyvolané zvýšení hladiny vápníku v buňce. Podtypy muskarinových receptorů označených lichou číslicí M1, M3 a M5 aktivují fosfolipasu C přes G-protein Gq, a tím stimulují uvolnění vápenatých iontů do cytoplasmy. Podtypy označené sudou číslicí M2 58 a M4 jsou přirozeně spřaženy s G-proteinem Gi, který inhibuje adenylátcyklasu. Pomocí promiskuitního G-proteinu G15, který byl vnesen do CHO buněk exprimující muskarinový podtyp M2 a M4 lze docílit napojení těchto receptorů (M2 a M4) na dráhu PLC, která je typická pro podtypy M1, M3 a M5. a tak testovat funkci všech podtypů pomocí jedné techniky stanovení zvýšení koncentrace vápenatých iontů v cytosolu (dráhou PLC dojde k otevření vápníkových kanálů na sarkoplasmatickém retikulu) [122]. Fluorescenční sonda Fura-2/AM po navázání vápenatých iontů mění své excitační maximum z 363 nm na 335 nm a lze tak pomocí ní stanovit koncentraci vápenatých iontů v cytosolu buňky. Karbacholem vyvolanou funkční odpověď v přítomnosti chinazolinových derivátů na všech pěti podtypech muskarinových receptorů bylo možné stanovit pomocí této jedné fluorescenční metody. Chinazolinové deriváty blokovaly karbacholem vyvolané uvolnění vápenatých iontů s potencí odpovídající jejich afinitě k jednotlivým podtypům. Z posunů koncentrace agonisty vyvolávající polovinu maximální odpovědi (EC50) byla provedena Schildova analýza, pomocí které byly získány hodnoty disociačních konstant alosterického ligandu KB popisující jejich potenci antagonizovat funkční odpověď receptoru. Z tvaru křivky Schildovy analýzy, která ukazuje závislost posunu EC50 na koncentraci chinazolinových ligandů (viz obrázek 16, strana 52), lze také určit mód interakce chinazolinových derivátů. Při vazbě ligandu do ortosterického vazebného místa by byla grafickým výsledkem Schildovy analýzy přímka, zatímco u alosterické interakce by došlo k jejímu zakřivení. V Schildově analýze u podtypů muskarinových receptorů označených sudou číslicí M2 a M4 dochází k saturaci účinku, což se projevuje zakřivením a to potvrzuje alosterický mód interakce. Chinazolinové deriváty se tedy váží do alosterického místa a alostericky inhibují aktivaci muskarinových receptorů. Výhoda vazby chinazolinových derivátů do méně konzervované alosterické oblasti muskarinových receptorů je, že jejich případná strukturní modifikace by mohla vést k žádoucí výraznější selektivitě k muskarinovým podtypům M2 a M3. Další výhodou alosterických ligandů je saturovatelnost jejich efektu, kdy při dalším zvyšování koncentrace těchto látek již nedochází k zvyšování jejich účinku, což značně zvětšuje terapeutické rozmezí používané dávky [129]. Chinazolinový derivát VN45b má asi 10× větší potenci na muskarinových receptorech M2 a M3 než VN14a podle funkčních pokusů, což odpovídá také tomu, že 59 VN45b má zhruba 10× větší afinitu k muskarinovým receptorům než VN14a. Strukturním rozdílem mezi VN45b a VN14a je navázaný brom u VN45b na sedmém uhlíku chinazolinové kostry (viz struktury – obrázek 11, strana 33). Protože mají chinazolinové deriváty jistou strukturní podobnost s takrinem, který silně inhibuje acetylcholinesterasu, byl v této práci také prozkoumán vliv chinazolinového derivátu VN45b na aktivitu acetylcholinesterasy na homogenátu myšího mozku, který obsahuje tento enzym. Výsledky ukázaly, že chinazolinový derivát VN45b má vliv na acetylcholinesterasu až při 100× vyšší koncentraci než je hodnota jeho KA vyjadřující jeho afinitu k muskarinovým receptorům M2 a M3. Při koncentraci odpovídající afinitě KA k muskarinovým receptorům M2 a M3 nebyl vliv na acetylcholinesterasu patrný. Látka VN45b byla navíc testována na Jesseniově lékarské fakultě Univerzity Komenského v Martine na Slovensku při inhalačních pokusech na morčatech, kterým byl vyvolán alergický zánět dýchacích cest pomocí ovalbuminu. Účinky látky VN45b byly porovnávány s ipratropiem, který je účinný pouze krátkodobě (zhruba 1 hodinu po podání). Zajímavým výsledkem bylo pozorování, že látka VN45b vykazovala účinnost i po 12 hodinách od podání. Tyto výsledky v současné době nejsou ještě publikovány. Předběžné výsledky od autorů Špulák a spol. 2014 naznačují možný účinek chinazolinových derivátů vícero mechanismy [7]. Jeden z mechanismů (muskarinový) je popsán v této diplomové práci. Další mechanismus, který se nabízí z hlediska vlivu na kontrakci hladké svaloviny, by mohl být agonistický účinek přes β2-adrenergní receptory, který by odpovídal již získaným výsledků z experimentů, kdy byla testována relaxace předem kontrahované průdušnice morčete s nebo bez propranololu, který blokuje β-adrenergní receptory. V budoucnu by bylo vhodné provést další strukturní modifikace chinazolinových derivátů s cílem zvýšit jejich afinitu a selektivitu k muskarinovým receptorům M2 a M3. Dále by bylo vhodné provést funkční a vazebnou analýzu dlouhodobého působení těchto nových látek na muskarinových receptorech. Zároveň by bylo vhodné též analyzovat působení na β adrenergních receptorech. Agonisté β2-adrenergních receptorů způsobují relaxaci hladké svaloviny a jsou také v současné době používány pro léčbu astmatu. Látky bifunkční povahy působící jako agonisté β2-adrenergních receptorů a antagonisté muskarinových M2 a M3 receptorů by mohly mít zajímavý léčebný 60 potenciál při onemocnění astmatem, ChOPN a dalších onemocněních postihující hladké svalstvo. 61 7 Závěr Výsledky předložené v diplomové práci ukázaly, že deriváty chinazolinu VN14a, VN15a, VN45b a VN122c se váží na všechny podtypy muskarinových receptorů. Chinazolinové deriváty mají nižší afinitu k podtypu muskarinového receptoru M5 oproti podtypům M1 až M4. Afinita chinazolinových derivátů mezi podtypy muskarinových receptorů M1 až M4 je srovnatelná. Kvůli chemické nestabilitě byly chinazolinové deriváty VN15a a VN122c vyřazeny z dalších pokusů. Vazebná kinetická a funkční analýza prokázala alosterický mód interakce chinazolinových derivátů VN14a a VN45b s muskarinovými receptory. Funkční analýza na muskarinových receptorech ukázala, že testované chinazolinové deriváty VN14a a VN45b blokují agonistou karbacholem vyvolanou aktivaci všech podtypů muskarinových receptorů. Látka VN45b je 10× účinnější v inhibici muskarinových receptorů než látka VN14a. Potence chinazolinových derivátů antagonizovat funkční odpověď odpovídá jejich afinitě k jednotlivým podtypům muskarinových receptorů. Výsledky diplomové práce ukazují, že bronchodilatační účinky chinazolinových derivátů pozorované Špulákem a spol. 2014 jsou tedy alespoň z části způsobené blokováním muskarinových receptorů M2 a M3. Dále bylo prokázáno u nejúčinnějšího chinazolinového derivátu VN45b, že i přes svou podobnost s inhibitorem acetylcholinesterasy takrinem, nemá ve farmakologicky relevantních koncentracích, které odpovídají jeho stanovené afinitě k muskarinovým receptorům, inhibiční vliv na aktivitu acetylcholinesterasy. 62 Seznam použité literatury [1] Bonner TI, Buckley NJ, Young AC, Brann MR. Identification of a family of muscarinic acetylcholine receptor genes. Science (80-. )., 237, 527–32 (1987). [2] Haga K, Kruse AC, Asada H, Yurugi-Kobayashi T, Shiroishi M, Zhang C, Weis WI, Okada T, Kobilka BK, Haga T, Kobayashi T. Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature, 482, 547–51 (2012). [3] Eglen RM. Overview of muscarinic receptor subtypes, (2012). [4] Ehlert FJ. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci., 74, 355–66 (2003). [5] Cukic V, Lovre V, Dragisic D, Ustamujic A. Asthma and Chronic Obstructive Pulmonary Disease (Copd) and #8211; Differences and Similarities. Mater. Socio Medica, 24, 100 (2012). [6] Mansfield L, Bernstein JA. Tiotropium in asthma: From bench to bedside, W.B. Saunders Ltd, (2019). [7] Špulák M, Pourová J, Vopršálová M, Mikušek J, Kuneš J, Vacek J, Ghavre M, Gathergood N, Pour M. Novel bronchodilatory quinazolines and quinoxalines: Synthesis and biological evaluation. Eur. J. Med. Chem., 74, 65–72 (2014). [8] Davies MN, Secker A, Freitas AA, Mendao M, Timmis J, Flower DR. On the hierarchical classification of G protein-coupled receptors. Bioinformatics, 23, 3113–8 (2007). [9] Ishii M, Kurachi Y. Muscarinic acetylcholine receptors. Curr. Pharm. Des., 12, 3573–81 (2006). [10] Billington CK, Ojo OO, Penn RB, Ito S. cAMP regulation of airway smooth muscle function. Pulm. Pharmacol. Ther., 26, 112–20 (2013). [11] Felder CC, Bymaster FP, Ward J, DeLapp N. Therapeutic opportunities for muscarinic receptors in the central nervous system, American Chemical Society , (2000). [12] Caulfield MP. Muscarinic Receptors-Characterization, coupling and function, Pharmacol Ther, (1993). [13] Jakubík J, Šantrůcková E, Randáková A, Janíčková H, Zimčík P, Rudajev V, Michal P, El-Fakahany EE, Doležal V. Outline of therapeutic interventions with muscarinic receptor-mediated transmission, Physiol Res, (2014). 63 [14] Jakubík J, El-Fakahany EE. Allosteric modulation of GPCRs of class a by cholesterol, MDPI AG, (2021). [15] “RCSB PDB - 3UON: Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist”.: , citováno: 26.3.2021, (2021). [16] Ballesteros JA, Weinstein H. Integrated methods for the construction of three- dimensional models and computational probing of structure-function relations in G protein-coupled receptors. Methods Neurosci., 25, 366–428 (1995). [17] Kruse AC, Ring AM, Manglik A, Hu J, Hu K, Eitel K, Hübner H, Pardon E, Valant C, Sexton PM, Christopoulos A, Felder CC, Gmeiner P, Steyaert J, Weis WI, Garcia KC, Wess J, Kobilka BK. Activation and allosteric modulation of a muscarinic acetylcholine receptor. Nature, 504, 101–6 (2013). [18] Trzaskowski B, Latek D, Yuan S, Ghoshdastider U, Debinski A, Filipek S. Action of Molecular Switches in GPCRs - Theoretical and Experimental Studies. Curr. Med. Chem., 19, 1090–109 (2012). [19] Hulme EC. GPCR activation: A mutagenic spotlight on crystal structures, Elsevier, (2013). [20] Bock A, Bermudez M. Allosteric coupling and biased agonism in G protein‐ coupled receptors. FEBS J., 288, 2513–28 (2021). [21] Randáková A, Jakubík J. Functionally selective and biased agonists of muscarinic receptors. Pharmacol. Res., 169, 105641 (2021). [22] Nathan PJ, Watson J, Lund J, Davies CH, Peters G, Dodds CM, Swirski B, Lawrence P, Bentley GD, O’Neill B V., Robertson J, Watson S, Jones GA, Maruff P, Croft RJ, Laruelle M, Bullmore ET. The potent M1 receptor allosteric agonist GSK1034702 improves episodic memory in humans in the nicotine abstinence model of cognitive dysfunction. Int. J. Neuropsychopharmacol., 16, 721–31 (2013). [23] Langmead CJ, Watson J, Reavill C. Muscarinic acetylcholine receptors as CNS drug targets, Pharmacol Ther, (2008). [24] Randáková A, Nelic D, Ungerová D, Nwokoye P, Su Q, Doležal V, El-Fakahany EE, Boulos J, Jakubík J. Novel M2 -selective, Gi -biased agonists of muscarinic acetylcholine receptors. Br. J. Pharmacol., (2019). [25] Conn PJ, Jones CK, Lindsley CW. Subtype-selective allosteric modulators of muscarinic receptors for the treatment of CNS disorders, Trends Pharmacol Sci, (2009). 64 [26] Jöhren K, Höltje HD. A model of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor. J. Comput. Aided. Mol. Des., 16, 795–801 (2002). [27] Broadley KJ, Kelly DR. Muscarinic receptor agonists and antagonists, Molecular Diversity Preservation International, (2001). [28] Bhat AS, Dustin Schaeffer R, Kinch L, Medvedev KE, Grishin N V. Recent advances suggest increased influence of selective pressure in allostery, Elsevier Ltd, (2020). [29] May LT, Avlani VA, Langmead CJ, Herdon HJ, Wood MD, Sexton PM, Christopoulos A. Structure-function studies of allosteric agonism at M2 muscarinic acetylcholine receptors. Mol. Pharmacol., 72, 463–76 (2007). [30] Kenakin T. G-protein coupled receptors as allosteric machines. Recept. Channels, 10, 51–60 (2004). [31] Tränkle C, Andresen I, Lambrecht G, Mohr K. M2 receptor binding of the selective antagonist AF-DX 384: Possible involvement of the common allosteric site. Mol. Pharmacol., 53, 304–12 (1998). [32] Barlow RB, Kitchen R. The actions of some esters of 4-hydroxyquinuclidine on guinea-pig ileum, atria and rat fundus strip. Br. J. Pharmacol., 77, 549–57 (1982). [33] Ma L, Seager M, Wittmann M, Jacobson M, Bickel D, Burno M, Jones K, Graufelds VK, Xu G, Pearson M, McCampbell A, Gaspar R, Shughrue P, Danziger A, Regan C, Flick R, Pascarella D, Garson S, Doran S, Kreatsoulas C, Veng L, Lindsley CW, Shipe W, Kuduk S, Sur C, Kinney G, Seabrook GR, Ray WJ. Selective activation of the M1 muscarinic acetylcholine receptor achieved by allosteric potentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106, 15950–5 (2009). [34] Marlo JE, Niswender CM, Days EL, Bridges TM, Xiang Y, Rodriguez AL, Shirey JK, Brady AE, Nalywajko T, Luo Q, Austin CA, Williams MB, Kim K, Williams R, Orton D, Brown HA, Lindsley CW, Weaver CD, Conn PJ. Discovery and characterization of novel allosteric potentiators of M1 muscarinic receptors reveals multiple modes of activity. Mol. Pharmacol., 75, 577–88 (2009). [35] Jakubík J, El-Fakahany EE. Allosteric modulation of muscarinic acetylcholine receptors, MDPI AG, (2010). [36] Lebois EP, Bridges TM, Lewis LM, Dawson ES, Kane AS, Xiang Z, Jadhav SB, Yin H, Kennedy JP, Meiler J, Niswender CM, Jones CK, Conn PJ, Weaver CD, Lindsley CW. Discovery and characterization of novel subtype-selective allosteric agonists for the investigation of M1 receptor function in the central nervous system. ACS Chem. Neurosci., 1, 104–21 (2010). 65 [37] Gregory KJ, Hall NE, Tobin AB, Sexton PM, Christopoulos A. Identification of orthosteric and allosteric site mutations in M 2 muscarinic acetylcholine receptors that contribute to ligand-selective signaling bias. J. Biol. Chem., 285, 7459–74 (2010). [38] Steinfeld T, Mammen M, Smith JAM, Wilson RD, Jasper JR. A novel multivalent ligand that bridges the allosteric and orthosteric binding sites of the M2 muscarinic receptor. Mol. Pharmacol., 72, 291–302 (2007). [39] Keov P, López L, Devine SM, Valant C, Lane JR, Scammells PJ, Sexton PM, Christopoulos A. Molecular mechanisms of bitopic ligand engagement with the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Biol. Chem., 289, 23817–37 (2014). [40] Levey AI. Immunological localization of m1-m5 muscarinic acetylcholine receptors in peripheral tissues and brain. Life Sci., 52, 441–8 (1993). [41] Fisher A. M1 muscarinic agonists target major hallmarks of Alzheimer’s disease - The pivotal role of brain M1 receptors, Neurodegenerative Diseases, Neurodegener Dis, pp.237–40 (2008). [42] Miyakawa T, Yamada M, Duttaroy A, Wess J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci., 21, 5239–50 (2001). [43] Anagnostaras SG, Murphy GG, Hamilton SE, Mitchell SL, Rahnama NP, Nathanson NM, Silva AJ. Selective cognitive dysfunction in acetylcholine M1 muscarinic receptor mutant mice. Nat. Neurosci., 6, 51–8 (2003). [44] Wess J, Eglen RM, Gautam D. Muscarinic acetylcholine receptors: Mutant mice provide new insights for drug development, Nat Rev Drug Discov, (2007). [45] Bymaster FP, Felder C, Ahmed S, McKinzie D. Muscarinic receptors as a target for drugs treating schizophrenia., Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, (2002). [46] Fisher A, Brandeis R, Haring R, Bar-Ner N, Kliger-Spatz M, Natan N, Sonego H, Marcovitch I, Pittel Z. Impact of muscarinic agonists for successful therapy of Alzheimer’s disease, Journal of Neural Transmission, Supplement, Springer Wien, pp.189–202 (2002). [47] Fisher A, Pittel Z, Haring R, Bar-Ner N, Kliger-Spatz M, Natan N, Egozi I, Sonego H, Marcovitch I, Brandeis R. M1 Muscarinic Agonists Can Modulate Some of the Hallmarks in Alzheimer’s Disease: Implications in Future Therapy. J. Mol. Neurosci., 20, 349–56 (2003). [48] Haass C, Selkoe DJ. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: Lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide, Nature Publishing Group, (2007). 66 [49] Citron M. Alzheimer’s disease: Strategies for disease modification, Nat Rev Drug Discov, (2010). [50] Davis AA, Fritz JJ, Wess J, Lah JJ, Levey AI. Deletion of M1 muscarinic acetylcholine receptors increases amyloid pathology in vitro and in vivo. J. Neurosci., 30, 4190–6 (2010). [51] Jakubík J, Michal P, Machová E, Dolezal V. Importance and prospects for design of selective muscarinic agonists. Physiol. Res., 57 Suppl 3, S39-47 (2008). [52] Cannon DM, Klaver JK, Gandhi SK, Solorio G, Peck SA, Erickson K, N Akula JS, Eckelman WC, Furey ML, Sahakian BJ, McMahon FJ, Drevets WC. Genetic variation in cholinergic muscarinic-2 receptor gene modulates M 2 receptor binding in vivo and accounts for reduced binding in bipolar disorder. Mol. Psychiatry, 16, 407–18 (2011). [53] Böhme TM, Keim C, Kreutzmann K, Linder M, Dingermann T, Dannhardt G, Mutschler E, Lambrecht G. Structure-activity relationships of dimethindene derivatives as new M2-selective muscarinic receptor antagonists. J. Med. Chem., 46, 856–67 (2003). [54] Harvey RD, Belevych AE. Muscarinic regulation of cardiac ion channels, Br J Pharmacol, (2003). [55] Fox RI, Konttinen Y, Fisher A. Use of muscarinic agonists in the treatment of Sjögren’s syndrome, Academic Press Inc., (2001). [56] Alabaster VA. Discovery and development of selective M3 antagonists for clinical use, Life Sciences, 21 February, Life Sci, pp.1053–60 (1997). [57] Pierce KL, Lefkowitz RJ. Classical and new roles of β-arrestins in the regulation of G-PROTEIN-COUPLED receptors. Nat. Rev. Neurosci., 2, 727–33 (2001). [58] Poulin B, Butcher A, McWilliams P, Bourgognon JM, Pawlak R, Kong KC, Bottrill A, Mistry S, Wess J, Rosethorne EM, Charlton SJ, Tobin AB. The M3- muscarinic receptor regulates learning and memory in a receptor phosphorylation/arrestin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 107, 9440–5 (2010). [59] Gautam D, Jeon J, Li JH, Han SJ, Hamdan FF, Cui Y, Lu H, Deng C, Gavrilova O, Wess J. Metabolic roles of the M3 muscarinic acetylcholine receptor studied with M3 receptor mutant mice: A review, J Recept Signal Transduct Res, (2008). [60] Trendelenburg AU, Gomeza J, Klebroff W, Zhou H, Wess J. Heterogeneity of presynaptic muscarinic receptors mediating inhibition of sympathetic transmitter release: A study with M 2- and M 4-receptor-deficient mice. Br. J. Pharmacol., 138, 469–80 (2003). 67 [61] Tzavara ET, Bymaster FP, Felder CC, Wade M, Gomeza J, Wess J, McKinzie DL, Nomikos GG. Dysregulated hippocampal acetylcholine neurotransmission and impaired cognition in M2, M4 and M2/M4 muscarinic receptor knockout mice. Mol. Psychiatry, 8, 673–9 (2003). [62] Chan WY, McKinzie DL, Bose S, Mitchell SN, Witkin JM, Thompson RC, Christopoulos A, Lazareno S, Birdsall NJM, Bymaster FP, Felder CC. Allosteric modulation of the muscarinic M4 receptor as an approach to treating schizophrenia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 105, 10978–83 (2008). [63] Gomeza J, Zhang L, Kostenis E, Felder C, Bymaster F, Brodkin J, Shannon H, Xia B, Deng CX, Wess J. Enhancement of D1 dopamine receptor-mediated locomotor stimulation in M4 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 96, 10483–8 (1999). [64] Böhme TM, Augelli-Szafran CE, Hallak H, Pugsley T, Serpa K, Schwarz RD. Synthesis and pharmacology of benzoxazines as highly selective antagonists at M4 muscarinic receptors. J. Med. Chem., 45, 3094–102 (2002). [65] Vilaró MT, Palacios JM, Mengod G. Localization of m5 muscarinic receptor mRNA in rat brain examined by in situ hybridization histochemistry. Neurosci. Lett., 114, 154–9 (1990). [66] Eglen RM, Nahorski SR. The muscarinic M5 receptor: A silent or emerging subtype?, John Wiley and Sons Inc., (2000). [67] Basile AS, Fedorova I, Zapata A, Liu X, Shippenberg T, Duttaroy A, Yamada M, Wess J. Deletion of the M5 muscarinic acetylcholine receptor attenuates morphine reinforcement and withdrawal but not morphine analgesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99, 11452–7 (2002). [68] Fink-Jensen A, Fedorova I, Wörtwein G, Woldbye DPD, Rasmussen T, Thomsen M, Bolwig TG, Knitowski KM, McKinzie DL, Yamada M, Wess J, Basile A. Role for M5 muscarinic acetylcholine receptors in cocaine addiction. J. Neurosci. Res., 74, 91–6 (2003). [69] Stahl E, Ellis J. Novel allosteric effects of amiodarone at the muscarinic M5 receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther., 334, 214–22 (2010). [70] Ehlert F, Thomas E, Gersten E, Griffin M. Muscarinic Receptors and Gastrointestinal Smooth Muscle. Biol. Chem. Environ. Sci. Fac. Books B. Chapters, 92–147 (1987). [71] Matsui M, Motomura D, Karasawa H, Fujikawa T, Jiang J, Komiya Y, Takahashi SI, Taketo MM. Multiple functional defects in peripheral autonomic organs in 68 mice lacking muscarinic acetylcholine receptor gene for the M3 subtype. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97, 9579–84 (2000). [72] Stengel PW, Gomeza J, Wess J, Cohen ML. M(2) and M(4) receptor knockout mice: muscarinic receptor function in cardiac and smooth muscle in vitro. J. Pharmacol. Exp. Ther., 292, 877–85 (2000). [73] Matsui M, Motomura D, Fujikawa T, Jiang J, Takahashi S ichi, Manabe T, Taketo MM. Mice lacking M2 and M3 muscarinic acetylcholine receptors are devoid of cholinergic smooth muscle contractions but still viable. J. Neurosci., 22, 10627– 32 (2002). [74] Knispel HH, Goessl C, Beckmann R. Nitric oxide mediates relaxation in rabbit and human corpus cavernosum smooth muscle. Urol. Res., 20, 253–7 (1992). [75] Tachado SD, Virdee K, Akhtar RA, Abdel-Latif AA. M3 Muscarinic Receptors Mediate an Increase in Both Inositol Trisphosphate Production and Cyclic AMP Formation in Dog Iris Sphincter Smooth Muscle. J. Ocul. Pharmacol., 10, 137– 47 (1994). [76] Rubanyi GM. Endothelium‐derived relaxing and contracting factors. J. Cell. Biochem., 46, 27–36 (1991). [77] Michel AD, Whiting RL. Direct binding studies on ileal and cardiac muscarinic receptors. Br. J. Pharmacol., 92, 755–67 (1987). [78] Griffin MT, Ehlert FJ. Specific inhibition of isoproterenol-stimulated cyclic AMP accumulation by M2 muscarinic receptors in rat intestinal smooth muscle. J. Pharmacol. Exp. Ther., 263, 221–5 (1992). [79] Fernandes LB, Fryer AD, Hirshman CA. M2 muscarinic receptors inhibit isoproterenol-induced relaxation of canine airway smooth muscle. J. Pharmacol. Exp. Ther., 262, 119–26 (1992). [80] Fryer AD, Elbon CL, Kim AL, Xiao HQ, Levey AI, Jacoby DB. Cultures of Airway Parasympathetic Nerves Express Functional M2 Muscarinic Receptors. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15, 716–25 (1996). [81] Doležal V, Tuček S, Hynie S. Effects of Pertussis Toxin Suggest a Role for G‐ Proteins in the Inhibition of Acetylcholine Release from Rat Myenteric Plexus by Opioid and Presynaptic Muscarinic Receptors. Eur. J. Neurosci., 1, 127–31 (1989). [82] Herlitze S, Garcla DE, Mackle K, Hille B, Scheuer T, Catterall WA. Modulation of Ca2+ channels by G-protein βγ subunits. Nature, 380, 258–62 (1996). 69 [83] Fryer AD, Maclagan J. Muscarinic inhibitory receptors in pulmonary parasympathetic nerves in the guinea‐pig. Br. J. Pharmacol., 83, 973–8 (1984). [84] Minette PAH, Lammers JWJ, Dixon CMS, McCusker MT, Barnes PJ. A muscarinic agonist inhibits reflex bronchoconstriction in normal but not in asthmatic subjects. J. Appl. Physiol., 67, 2461–5 (1989). [85] Kusel MMH, de Klerk NH, Kebadze T, Vohma V, Holt PG, Johnston SL, Sly PD. Early-life respiratory viral infections, atopic sensitization, and risk of subsequent development of persistent asthma. J. Allergy Clin. Immunol., 119, 1105–10 (2007). [86] Bush RK, Peden DB. Advances in environmental and occupational disorders in 2008. J. Allergy Clin. Immunol., 123, 575–8 (2009). [87] Busse WW, Lemanske RF. Expert Panel Report 3: Moving forward to improve asthma care, J Allergy Clin Immunol, (2007). [88] Sly PD, Boner AL, Björksten B, Bush A, Custovic A, Eigenmann PA, Gern JE, Gerritsen J, Hamelmann E, Helms PJ, Lemanske RF, Martinez F, Pedersen S, Renz H, Sampson H, von Mutius E, Wahn U, Holt PG. Early identification of atopy in the prediction of persistent asthma in children, Lancet, (2008). [89] Pahal P, Avula A, Sharma S. Emphysema. (2021). [90] Laniado-Laborin R. Smoking and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Parallel epidemics of the 21st century, Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), (2009). [91] Vogelmeier CF, Criner GJ, Martinez FJ, Anzueto A, Barnes PJ, Bourbeau J, Celli BR, Chen R, Decramer M, Fabbri LM, Frith P, Halpin DMG, López Varela MV, Nishimura M, Roche N, Rodriguez-Roisin R, Sin DD, Singh D, Stockley R, Vestbo J, Wedzicha JA, Agusti A. Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. Respirology, 22, 575–601 (2017). [92] Decramer M, Janssens W, Miravitlles M. Chronic obstructive pulmonary disease, The Lancet, Elsevier B.V., pp.1341–51, (2012). [93] Buhl R, FitzGerald JM, Busse WW. Tiotropium add-on to inhaled corticosteroids versus addition of long-acting β2-agonists for adults with asthma, W.B. Saunders Ltd, (2018). [94] O’Connor BJ, Towse LJ, Barnes PJ. Prolonged effect of tiotropium bromide on methacholine-induced bronchoconstriction in asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 154, 876–80 (1996). 70 [95] Matera MG, Rinaldi B, Berardo C, Rinaldi M, Cazzola M. A review of the pharmacokinetics of M3 muscarinic receptor antagonists used for the treatment of asthma, Taylor and Francis Ltd, (2020). [96] Holguin F, Cardet JC, Chung KF, Diver S, Ferreira DS, Fitzpatrick A, Gaga M, Kellermeyer L, Khurana S, Knight S, McDonald VM, Morgan RL, Ortega VE, Rigau D, Subbarao P, Tonia T, Adcock IM, Bleecker ER, Brightling C, Boulet LP, Cabana M, Castro M, Chanez P, Custovic A, Djukanovic R, Frey U, Frankemölle B, Gibson P, Hamerlijnck D, Jarjour N, Konno S, Shen H, Vitary C, Bush A. Management of severe asthma: A European Respiratory Society/American Thoracic Society guideline. Eur. Respir. J., 55, (2020). [97] Kistemaker LEM, Hiemstra PS, Bos IST, Bouwman S, Van Den Berge M, Hylkema MN, Meurs H, Kerstjens HAM, Gosens R. Tiotropium attenuates IL- 13-induced goblet cell metaplasia of human airway epithelial cells. Thorax, 70, 668–76 (2015). [98] Hoshino M, Ohtawa J, Akitsu K. Effects of the addition of tiotropium on airway dimensions in symptomatic asthma. Allergy Asthma Proc., 37, e147–53 (2016). [99] Grainge CL, Lau LCK, Ward JA, Dulay V, Lahiff G, Wilson S, Holgate S, Davies DE, Howarth PH. Effect of Bronchoconstriction on Airway Remodeling in Asthma. N. Engl. J. Med., 364, 2006–15 (2011). [100] Holtzman MJ, McNamara MP, Sheppard D, Fabbri LM, Hahn HL, Graf PD, Nadel JA. Intravenous versus inhaled atropine for inhibiting bronchoconstrictor responses in dogs. J. Appl. Physiol. Respir. Environ. Exerc. Physiol., 54, 134–9 (1983). [101] Chen WY, Brenner AM, Weiser PC, Chai H. Atropine and exercise-induced bronchoconstriction. Chest, 79, 651–6 (1981). [102] Anthonisen NR, Connett JE, Kiley JP, Altose MD, Bailey WC, Buist AS, Conway WA, Enright PL, Kanner RE, O’Hara P. Effects of smoking intervention and the use of an inhaled anticholinergic bronchodilator on the rate of decline of FEV1. The Lung Health Study. JAMA, 272, 1497–505 (1994). [103] Peters SP, Kunselman SJ, Icitovic N, Moore WC, Pascual R, Ameredes BT, Boushey HA, Calhoun WJ, Castro M, Cherniack RM, Craig T, Denlinger L, Engle LL, DiMango EA, Fahy J V., Israel E, Jarjour N, Kazani SD, Kraft M, Lazarus SC, Lemanske RF, Lugogo N, Martin RJ, Meyers DA, Ramsdell J, Sorkness CA, Sutherland ER, Szefler SJ, Wasserman SI, Walter MJ, Wechsler ME, Chinchilli VM, Bleecker ER. Tiotropium Bromide Step-Up Therapy for Adults with Uncontrolled Asthma. N. Engl. J. Med., 363, 1715–26 (2010). 71 [104] Haddad EB, Mak JC, Barnes PJ. Characterization of [3H]Ba 679 BR, a slowly dissociating muscarinic antagonist, in human lung: radioligand binding and autoradiographic mapping. Mol. Pharmacol., 45, 899–907 (1994). [105] Disse B, Reichl R, Speck G, Traunecker W, Rominger KL, Hammer R. Ba 679 BR, A novel long-acting anticholinergic bronchodilator. Life Sci., 52, 537–44 (1993). [106] Price D, Sharma A, Cerasoli F. Biochemical properties, pharmacokinetics and pharmacological response of tiotropium in chronic obstructive pulmonary disease patients, Expert Opin Drug Metab Toxicol, (2009). [107] Vincken W, Bantje T, Middle M V., Gerken F, Moonen D. Long-Term Efficacy and Safety of Ipratropium Bromide plus Fenoterol via Respimat® Soft MistTM Inhaler (SMI) versus a Pressurised Metered-Dose Inhaler in Asthma. Clin. Drug Investig., 24, 17–28 (2004). [108] D’Urzo AD, Jugovic P, Jhirad R, Bouchard J. Four-year trial of tiotropium in chronic obstructive pulmonary disease. Can. Fam. Physician, 58, 848–9 (2012). [109] Norman P. Long-acting muscarinic M3 receptor antagonists. Expert Opin. Ther. Pat., 16, 1315–20 (2006). [110] Gavaldà A, Miralpeix M, Ramos I, Otal R, Carreño C, Viñals M, Doménech T, Carcasona C, Reyes B, Vilella D, Gras J, Cortijo J, Morcillo E, Llenas J, Ryder H, Beleta J. Characterization of aclidinium bromide, a novel inhaled muscarinic antagonist, with long duration of action and a favorable pharmacological profile. J. Pharmacol. Exp. Ther., 331, 740–51 (2009). [111] Gavaldà A, Ramos I, Carcasona C, Calama E, Otal R, Montero JL, Sentellas S, Aparici M, Vilella D, Alberti J, Beleta J, Miralpeix M. The invitro and invivo profile of aclidinium bromide in comparison with glycopyrronium bromide. Pulm. Pharmacol. Ther., 28, 114–21 (2014). [112] Haddad EB, Patel H, Keeling JE, Yacoub MH, Barnes PJ, Belvisi MG. Pharmacological characterization of the muscarinic receptor antagonist, glycopyrrolate, in human and guinea-pig airways. Br. J. Pharmacol., 127, 413–20 (1999). [113] Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010, J Nat Prod, (2012). [114] Gupta OP, Sharma ML, Ghatak BJ, Atal CK. Pharmacological investigations of vasicine and vasicinone--the alkaloids of Adhatoda vasica. Indian J. Med. Res., 66, 680–91 (1977). 72 [115] Ojo B, Findsen LA, Igarashi N, Kong B, Chowdhury BK. Synthesis and bronchodilatory activity of four new derivatives of deoxyvasicine. Drug Des. Discov., 14, 1–14 (1996). [116] Johri RK, Zutshi U. Mechanism of action of 6, 7, 8, 9, 10, 12-hexahydro-azepino- [2, 1-b] quinazolin-12-one-(RLX)--a novel bronchodilator. Indian J. Physiol. Pharmacol., 44, 75–81 (2000). [117] Hardtmann GE, Koletar G, Gogerty JH, Iorio LC. Synthesis and Biological Evaluation of Some 10-Substituted 2,3-Dihydroimidazo[2,1-b]quinazolin- 5(10H)-ones, a New Class of Bronchodilators. J. Med. Chem., 18, 447–53 (1975). [118] Zabeer A, Bhagat A, Gupta OP, Singh GD, Youssouf MS, Dhar KL, Suri OP, Suri KA, Satti NK, Gupta BD, Qazi GN. Synthesis and bronchodilator activity of new quinazolin derivative. Eur. J. Med. Chem., 41, 429–34 (2006). [119] Nash MS, Selkirk J V., Gaymer CE, Challiss RAJ, Nahorski SR. Enhanced inducible mGlu1α receptor expression in Chinese hamster ovary cells. J. Neurochem., 77, 1664–7 (2001). [120] LOWRY OH, ROSEBROUGH NJ, FARR AL, RANDALL RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265–75 (1951). [121] Peterson GL. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal. Biochem., 83, 346–56 (1977). [122] Zhu T, Fang LY, Xie X. Development of a universal high-throughput calcium assay for G-protein-coupled receptors with promiscuous G-protein Gα15/16. Acta Pharmacol. Sin., 29, 507–16 (2008). [123] Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties, 1985. [124] Jakubík J, Randáková A, El-Fakahany EE, Doležal V. Analysis of equilibrium binding of an orthosteric tracer and two allosteric modulators. PLoS One, 14, (2019). [125] Kenakin T. A Pharmacology Primer. Elsevier Inc., (2006). [126] Jakubík J, Randáková A, Chetverikov N, El-Fakahany EE, Doležal V. The operational model of allosteric modulation of pharmacological agonism. Sci. Rep., 10, (2020). [127] Kostenis E, Mohr K. Two-point kinetic experiments to quantify allosteric effects on radioligand dissociation. Trends Pharmacol. Sci., 17, 280–3 (1996). 73 [128] May LT, Leach K, Sexton PM, Christopoulos A. Allosteric modulation of G protein-coupled receptors, Annu Rev Pharmacol Toxicol, (2007). [129] Jakubik J, El-Fakahany EE. Current advances in allosteric modulation of muscarinic receptors. Biomolecules, 10, (2020). 74 Přílohy I Syntéza chinazolinových derivátů VN14a, VN15a, VN45b a VN122c 75 Svoluji k zapůjčení této práce pro studijní účely a prosím, aby byla řádně vedena evidence vypůjčovatelů. Jméno a příjmení Číslo OP Datum vypůjčení Poznámka S adresou 76